磷脂酶D(Phospholipase D,簡稱PLD;EC 3.1.4.4)屬磷脂酶超家族,主要作用于磷脂酰膽堿生成信號分子磷脂酸與膽堿。在醫(yī)藥行業(yè),可以利用磷脂酶D的堿基交換反應對磷脂進行改性,以制備單一磷脂和稀有磷脂。隨著應用的不斷深入,對磷脂酶D的屬性要求特別是生物活性與生化特征多樣性的要求也越來越迫切。為此,本文通過對黑曲霉基因組中2個未知功能的磷脂酶D基因進行了克隆表達與生化特征解析,獲得了如下主要結(jié)果:從黑曲霉基因組中篩查到2個疑似編碼磷脂酶D的開放閱讀框,pldA和pldB。二者的大小分別為2499 bp和3645 bp,分別編碼832和1214個氨基酸殘基;進一步通過氨基酸序列比對可知,PldA和PldB分別與來源于A.nidulans FGSC 26和A.kawachiiIFO 4308的磷脂酶D具有較高相似性,相似度分別為81.35%和95.60%,二者皆具有2個高度保守的HKD基序HxKxxxxDxxxxxxGS(G)和真菌磷脂酶D特有的基序YIENQFF,屬于真菌磷脂酶D家族。提取黑曲霉CICIM F0510的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板,成功將pldA和pldB基因在畢赤酵母中進行了克隆表達,構(gòu)建獲得了 2株重組畢赤酵母菌GS-pldA和GS-pldB;搖瓶發(fā)酵水平上,重組磷脂酶PldA和PldB的酶活分別為0.59和0.43 U/mL;進一步通過硫酸銨沉淀、脫鹽和凝膠過濾層析對它們進行純化后,PldA和PldB的純化倍數(shù)和得率分別為22.2倍和25.1%,47.9倍和31.7%。進一步分析其酶學性質(zhì),重組磷脂酶PldA的最適作用溫度和最適作用pH分別是30℃和7.0,在30℃-50℃和pH 7.0-9.0下具有較好的穩(wěn)定性;重組磷脂酶PldB的最適作用溫度和最適作用pH分別為40℃和6.0,在30℃-40℃或pH 5.0-7.0下具有較好的穩(wěn)定性;Ca2+、Mn2+、Ba2+和10%Tris對這兩種磷脂酶D皆有顯著的促進作用,乙腈則可使兩個磷脂酶完全失活,而其他金屬離子和化學試劑對二者均有不同程度的抑制作用;二者可在4℃下穩(wěn)定保存30 d以上。兩個磷脂酶均可水解底物卵磷脂生成磷脂酸。
【學位單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;Q55
【部分圖文】：

革蘭氏陽性菌；Ｇ＿，革蘭氏陰性菌??１．１．３磷脂酶Ｄ的反應機理??磷脂酶Ｄ—般可以催化兩種反應（圖１－１）：其一，水解磷脂分子中的磷酸和有??機堿（如乙醇胺、膽堿等）羥基成酯鍵，生成磷脂酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ?ａｃｉｄ，ＰＡ）和有??機堿。ＰＬＤ水解反應的主要底物是磷脂酰膽堿（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＰＣ），在某些生物??體中ＰＬＤ也可以水解磷脂酰乙醇胺（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，?ＰＥ）［４４］和磷脂酰肌醇??（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ，ＰＩ）［４５］。其二，ＰＬＤ還可以催化各種羥基化合物與磷脂堿基結(jié)??合形成新的憐脂，這一重要特性稱為ＰＬＤ的堿基交換反應（Ｂａｓｅ?ｅｘｃｈａｎｇｅ??ｒｅａｃｔｉｏｎ），也稱轉(zhuǎn)磷脂反應（Ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）?［４６］。但也有報道稱極少數(shù)??ＰＬＤ只有水解活性［４７，４８］。利用ＰＬＤ的堿基交換活性可以合成稀有磷脂和單一磷脂，??比如磷脂酰絲氨酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ

?—１８Ｓ??圖３－３總ＲＮＡ的提取結(jié)果??Ｆｉｇ．?３－３?Ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ??３．２．２磷脂酶Ｄ目的基因的擴增??以黑曲霉的總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄生成的ｃＤＮＡ為模板，以表２－１兩組引物進行目的基??因的擴增。使用０．８％的瓊脂糖凝膠檢測ＰＣＲ產(chǎn)物。電泳結(jié)果如圖３－４所示，所擴增??的；？／以和；？Ｗ５的片段大小分別為２．５?ｋｂ和３．６?ｋｂ，與其預期大�。ǚ謩e是２４９９和??３６４５?ｂｐ）相符。而且條帶單一、清晰，表明基因克隆成功。??Ｍ?１?Ｍ?２??擊，制??國??圖３－４目的基因ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??Ｍ：?ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ?１?ｋｂ?Ｐｌｕｓ?ＤＮＡ?Ｌａｄｄｅｒ；?１：鱗脂酶基因ｐ／以，？?２：鱗脂酶基因尸／必??３．３磷脂酶Ｄ重組菌的構(gòu)建與表達??３．３．１重組質(zhì)粒的構(gòu)建??將ＰＣＲ獲得的目的基因片段用ＡＴｗＩ進行酶切，經(jīng)純化回收后，用Ｔ４ＤＮＡ連接??酶將其與經(jīng)過１和ＩＩ雙酶切的質(zhì)粒ｐＰＩＣ９Ｋ進行連接。重組質(zhì)粒構(gòu)建方式如??圖３－５所示。??２９??

３．２．２磷脂酶Ｄ目的基因的擴增??以黑曲霉的總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄生成的ｃＤＮＡ為模板，以表２－１兩組引物進行目的基??因的擴增。使用０．８％的瓊脂糖凝膠檢測ＰＣＲ產(chǎn)物。電泳結(jié)果如圖３－４所示，所擴增??的；？／以和；？Ｗ５的片段大小分別為２．５?ｋｂ和３．６?ｋｂ，與其預期大小（分別是２４９９和??３６４５?ｂｐ）相符。而且條帶單一、清晰，表明基因克隆成功。??Ｍ?１?Ｍ?２??擊，制??國??圖３－４目的基因ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??Ｍ：?ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ?１?ｋｂ?Ｐｌｕｓ?ＤＮＡ?Ｌａｄｄｅｒ；?１：鱗脂酶基因ｐ／以，？?２：鱗脂酶基因尸／必??３．３磷脂酶Ｄ重組菌的構(gòu)建與表達??３．３．１重組質(zhì)粒的構(gòu)建??將ＰＣＲ獲得的目的基因片段用ＡＴｗＩ進行酶切，經(jīng)純化回收后，用Ｔ４ＤＮＡ連接??酶將其與經(jīng)過１和ＩＩ雙酶切的質(zhì)粒ｐＰＩＣ９Ｋ進行連接。重組質(zhì)粒構(gòu)建方式如??圖３－５所示。??２９??
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