【摘要】：冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白(CSPs)是含有不同數(shù)量冷休克結(jié)構(gòu)域(cold shock domain,CSD)的低溫響應(yīng)蛋白,在低溫脅迫中發(fā)揮重要作用。以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)為材料,克隆得到了冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白基因AmCSDP。生物信息學(xué)分析顯示AmCSDP(Gen Bank登錄號:KX756575)全長540bp,編碼180個氨基酸,二級結(jié)構(gòu)由8.9%的α–螺旋、47.8%的β–折疊和43.3%的無規(guī)則卷曲組成,其N端含有冷休克結(jié)構(gòu)域。進化分析表明沙冬青與花生同源性最高。構(gòu)建了AmCSDP真核表達載體Pcambia2300-35S-AmCSDP-OCS,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入本氏煙中。對轉(zhuǎn)基因T1代和野生型煙草進行4℃低溫脅迫處理,結(jié)果證實轉(zhuǎn)基因本氏煙比野生型的耐冷能力強。
【圖文】：

王紅蕾，王艷萍，于婷喬，劉勝利，陳玉珍，盧存福.沙冬青AmCSDP基因特性及轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性分析.園藝學(xué)報，2017，44(4)：712–722.7151.6真核表達載體的構(gòu)建及煙草的轉(zhuǎn)化與鑒定選用真核表達載體引物（表1），以沙冬青cDNA為模板構(gòu)建真核表達載體Pcambia2300-35S-AmCSDP-OCS（方法同1.4），提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤侵染法將重組載體2300-AmCSDP轉(zhuǎn)化到野生型煙草中，將T1代煙草種子播種在含150mg·L-1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗，之后轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)。CTAB法提取T1代不同株系轉(zhuǎn)基因煙草DNA，同時提取總蛋白，PCR和Westernblot檢測AmCSDP在煙草中表達。1.7轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性鑒定在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)AmCSDP的T1代煙草種子和野生型煙草種子12h（25℃，16h光照/8h黑暗）。低溫處理：4℃處理3h，恢復(fù)培養(yǎng)10d后統(tǒng)計發(fā)芽率，試驗重復(fù)3次。取轉(zhuǎn)AmCSDP的T1代株系C2和野生型本氏煙種子各30粒，在MS培養(yǎng)基中長至4片葉后，放入4~6℃黑暗中分別低溫處理1h、3h、1d、3d、10d、20d，25℃恢復(fù)培養(yǎng)15d后觀察植株表型變化并計算存活率。同時，取轉(zhuǎn)AmCSDP的T1代株系C2和野生型本氏煙種子各6粒，營養(yǎng)土中培養(yǎng)42d后，放入4~6℃黑暗中低溫脅迫處理7d。冷脅迫后室溫恢復(fù)培養(yǎng)7d，觀察表型變化，進一步分析基因功能。2結(jié)果與分析2.1AmCSDP生物信息學(xué)分析沙冬青冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白基因AmCSDP（GenBank登錄號KX756575）的ORF為540bp，預(yù)測編碼180個氨基酸（圖1），其分子式為C934H1477N237O250S10，相對分子質(zhì)量20.35kD；不穩(wěn)定參數(shù)36.38，其蛋白為不穩(wěn)定蛋白；總親水平均系數(shù)0.150，為親水蛋白。圖1AmCSDP全長cDNA序列及氨基酸序列Fig.1cDNAfullsequenceandcorrespondingaminoacidsequenceofAmCSDP

2。結(jié)果表明，沙冬青最保守，并且沙冬青AmCSDP與豆科的花生（Arachisipaensis）具有更高的同源性。圖2AmCSDP與其他含有同源序列植物的系統(tǒng)進化關(guān)系Fig.2PhylogeneticanalysisofAmCSDPandotherreportedproteins2.2在大腸桿菌中表達AmCSDPIPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達如圖3所示，與空對照BP菌相比，CSP1+、CSP2+菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后有約20.3kD的蛋白過量表達，且與AmCSDP理論預(yù)測值相同，表明已誘導(dǎo)出所需目的蛋白。將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的超表達AmCSDP從聚丙烯酰胺凝膠中切下，用液氮研碎溶于磷酸緩沖液中作為抗原，免疫小白鼠獲得抗體。圖3AmCSDP在轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中表達CSP1、CSP2：不同的BL21克隆中表達AmCSDP；BP：空載體PET30a；“+”：加IPTG誘導(dǎo)；“–”：未加IPTG誘導(dǎo)；M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。Fig.3ExpressionofAmCSDPinE.coliBL21CSP1，CSP2：OverexpressionofAmCSDP；BP：OverexpressionofPET30a；“+”：IPTGinducted；“–”：NotIPTGinduced；M：Standardproteininmarker.

SDP的二級結(jié)構(gòu)由8.9%的α–螺旋、47.8%的β–折疊和43.3%的無規(guī)則卷曲組成。將AmCSDP與庫中的已知同源蛋白晶體結(jié)構(gòu)比對并進行三維重構(gòu)。SWISS-MODEL預(yù)測了AmCSDP的主鏈構(gòu)象，AmCSDP的N端序列含有5個反向平行的β–折疊形成的桶形結(jié)構(gòu)，即冷休克結(jié)構(gòu)域（類S1結(jié)構(gòu)域）。為了進一步研究AmCSDP與其他植物中抗逆蛋白之間的進化關(guān)系，用BioEdit及MAGA4.0軟件對AmCSDP與13種植物的氨基酸序列進行多重序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹如圖2。結(jié)果表明，沙冬青最保守，并且沙冬青AmCSDP與豆科的花生（Arachisipaensis）具有更高的同源性。圖2AmCSDP與其他含有同源序列植物的系統(tǒng)進化關(guān)系Fig.2PhylogeneticanalysisofAmCSDPandotherreportedproteins2.2在大腸桿菌中表達AmCSDPIPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達如圖3所示，與空對照BP菌相比，CSP1+、CSP2+菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后有約20.3kD的蛋白過量表達，且與AmCSDP理論預(yù)測值相同，表明已誘導(dǎo)出所需目的蛋白。將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的超表達AmCSDP從聚丙烯酰胺凝膠中切下，用液氮研碎溶于磷酸緩沖液中作為抗原，免疫小白鼠獲得抗體。圖3AmCSDP在轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中表達CSP1、CSP2：不同的BL21克隆中表達AmCSDP；BP：空載體PET30a；“+”：加IPTG誘導(dǎo)；“–”：未加IPTG誘導(dǎo)；M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。Fig.3ExpressionofAmCSDPinE.coliBL21CSP1，CSP2：OverexpressionofAmCSDP；BP：OverexpressionofPET30a；“+”：IPTGinducted；“–”：NotIPTGinduced；M：Standardproteininmarker.
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本文編號：2877201