發(fā)布時間：2020-11-04 06:39

　　 第一部分重組慢病毒介導的MCM7基因沉默對白血病K562細胞生物學效應的影響及其機制的研究目的:鑒于特異性抑制MCM7基因表達能夠抑制白血病的發(fā)生發(fā)展,研究抑制微小染色體維持蛋白7 (minichromosome maintenance protein, MCM7)后相關(guān)基因表達的變化,為進一步了解白血病的發(fā)生機制和將MCM7引入白血病的基因靶向治療提供實驗理論依據(jù)。方法:1、Easy-siRNA設計:通過Genebank找到MCM7mRNA序列,設計3條針對MCM7編碼區(qū)的siRNA靶序列,并經(jīng)Blast確定序列特異性,在序列兩端加相應的限制性內(nèi)切酶切位點。2、目的慢病毒載體的構(gòu)建:3種帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)篩選標記的MCM7基因沉默重組慢病毒顆粒LV-MCM7-RNAi(23977-1),LV-MCM7-RNAi(23978-1),LV-MCM7-RNAi(23979-1)及陰性對照重組病毒 LV-NC-RNAi,構(gòu)建 MCM7 特異性shRNA重組病毒。3、3種MCM7特異性shRNA重組病毒分別轉(zhuǎn)染K562細胞株,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。Real-time PCR分別檢測MCM7轉(zhuǎn)錄水平,篩選出靶點敲減效率最高的一種重組慢病毒顆粒。4、通過Real-time PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后對MCM7轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達的抑制情況。5、按照重組病毒干預與否,分為LV-MCM7-RNAi組、LV-NC-RNAi對照組和空白對照組。體外通過應用FCM檢測K562細胞周期及凋亡情況。體外探討特異性抑制MCM7的表達對K562細胞的生物學特性的影響。6、采用Real-time PCR及Western blot法進行驗證,找尋起關(guān)鍵作用的信號途徑,初步闡明MCM7在白血病的作用和分子機制。7、建立白血病移植瘤的動物模型:BALB/C裸鼠隨機分為3組,建立局部移植瘤模型。每天觀察裸鼠背部移植瘤的成瘤和生長情況,繪腫瘤生長曲線,每4天記錄一次。8、腫瘤病理組織學檢查:取各組裸鼠的腫瘤組織Real-time PCR和Western blot檢測腫瘤標本內(nèi)MCM7基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達。同時制作病理切片進行免疫組化染色。結(jié)果:熒光顯微鏡顯示重組病毒對目的細胞的感染效率90%, Real-time PCR及Western blot顯示LV-MCM7-RNAi組與LV-NC-RNAi組和空白對照組相比,MCM7基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達均顯著下調(diào),靶點敲減效率分別達(92.3±1.88) %和(91.18±0.93) %。CCK8結(jié)果顯示:自第24h起,穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞的增殖與兩組對照細胞相比明顯受抑制。FCM結(jié)果顯示LV-MCM7-RNAi組較LV-NC-RNAi組和空白對照組G0/G1期細胞比例明顯增加,而S期顯著減少,M期也有小幅度減少,細胞周期被阻滯在G1期。FCM凋亡檢測LV-MCM7-RNAi組細胞凋亡率為(45.12±1.68)%,明顯高于 LV-MCM7-RNAi 組(7.96士0.85)%和空白對照組(8.37±1.02)%。Western blot 顯示 LV-MCM7-RNAi 組的 Polo-Like 激酶 1 ( PLK1)及磷酸化的PLK1(p-PLK1)均較LV-NC-RNAi組和空白對照組表達明顯下調(diào),而P73、bax基因表達上調(diào)。實驗動物模型生長曲線表明LV-shRNA-MCM7重組病毒組裸鼠的腫瘤生長明顯慢于LV-shRNA-negative對照組和空白對照組。結(jié)論:MCM7基因沉默使腫瘤細胞被阻滯在G1期,DNA無法復制,增殖受抑制。因周期阻滯作用,PLK1基因無法激活,PLK1及pPLK1蛋白表達下調(diào),從而使其對抑癌基因p73基因轉(zhuǎn)活性的抑制作用降低,p73基因及其下游基因bax表達上調(diào),導致腫瘤細胞凋亡增加。第二部分重組慢病毒介導的MCM7基因沉默對肝癌MHCC-97H細胞生物學效應的影響目的:本研究探討應用慢病毒介導的RNAi技術(shù)特異性沉默MCM7基因?qū)Ω伟┘毎鸐HCC-97H生物學效應的影響。方法:以人MCM7編碼序列作為干擾靶點,構(gòu)建靶向MCM7的shRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染肝癌細胞MHCC-97H,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。按照重組病毒干預與否,分為LV-MCM7-RNAi組、LV-NC-RNAi對照組和空白對照組。應用實時定量PCR及Western blot檢測各組肝癌細胞MCM7表達的變化。MTT檢測細胞增殖情況,流式細胞技術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡,劃痕法檢測遷移能力改變,Transwell侵襲小室實驗以穿膜細胞的數(shù)量評估各組肝癌細胞的侵襲能力。結(jié)果:熒光顯微鏡顯示重組病毒對目的細胞的感染效率90%, Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示LV-MCM7-RNAi組MCM7 mRNA及蛋白的表達水平較陰性對照組(LV-NC-RNAi)及空白對照組顯著降低(P0.05)。MTT結(jié)果顯示LV-MCM7-RNAi組細胞增殖速度顯著抑制(P0.01)。流式細胞儀檢測細胞周期顯示LV-MCM7-RNAi組較LV-NC-RNAi組和空白對照組G0/G1期細胞比例明顯增加,而S期顯著減少,細胞周期被阻滯在G1期。同時LV-MCM7-RNAi組的細胞凋亡率顯著增加。在MCM7基因有效沉默后,肝癌細胞MHCC-97H的侵襲及遷移能力顯著下降(P0.05)。結(jié)論:慢病毒介導的shRNA能有效沉默肝癌MHCC-97H細胞MCM7基因的表達,腫瘤細胞的細胞周期被阻滯于GO/G1期,并能誘導腫瘤細胞凋亡。同時,MCM7基因沉默可抑制肝癌MHCC-97H細胞的體外增殖、侵襲等生物學效應。
【學位單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R733.7
【部分圖文】：

?ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ??Ｌ＾＾ｔｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ?＾ｉｎａｃｔｉｖｅ?＾??圖１－１：?ＭＣＭ在細胞周期中的調(diào)控作用［７７］??■ｉｌｌｌｉｆ?Ｐ—??＾?ＭＣＨ７?ｇｅｎｏｍｅ?＃??／?人?？??＊?ｍｉＲ１０６ｂ－２５?ｐ２ｌ?ｍＲＮＡ??，Ｕ?＾?；？?＾??多：？：?４?＞？??ＩＩ？?？?Ｊ?Ｐ??＾?？?＾??ｚ?＿?一??＾?＾ｇｉ??圖１－２：?ＭＣＭ７致癌信號通路圖［７８］??９??

圖１－１：?ＭＣＭ在細胞周期中的調(diào)控作用［７７］??Ｐ—??

圖１－３ｓｈＲＮＡ作用過程??１．２．２設計原則：??１．２．２．１克隆到ｓｈＲＮＡ表達載體中的ｓｈＲＮＡ包括兩個短反向重復序列，中間由？？蓮環(huán)（ｌｏｏｐ）??序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由ｐｏｌＩＩＩ啟動子控制。隨后在連上５－６個Ｔ作為ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ??的轉(zhuǎn)錄終止子。??１．２．２．２兩個互補的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點。??１．２．２．３?ＳｔｒａｔａＧＥＮＥ發(fā)現(xiàn)２９個寡核苷酸較之原先推薦的２３個寡核苷酸可以更有效的抑制丨丨??的基因。??１．２．２．４在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個Ｃ，使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確??保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。??１．２．２．５?ｓｈＲＮＡ目的序列的第？個堿基必須是Ｇ以確保ＲＮＡ聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序??，一。??
【參考文獻】

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本文編號：2869765