第一部分重組慢病毒介導(dǎo)的MCM7基因沉默對(duì)白血病K562細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響及其機(jī)制的研究目的:鑒于特異性抑制MCM7基因表達(dá)能夠抑制白血病的發(fā)生發(fā)展,研究抑制微小染色體維持蛋白7 (minichromosome maintenance protein, MCM7)后相關(guān)基因表達(dá)的變化,為進(jìn)一步了解白血病的發(fā)生機(jī)制和將MCM7引入白血病的基因靶向治療提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。方法:1、Easy-siRNA設(shè)計(jì):通過(guò)Genebank找到MCM7mRNA序列,設(shè)計(jì)3條針對(duì)MCM7編碼區(qū)的siRNA靶序列,并經(jīng)Blast確定序列特異性,在序列兩端加相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)。2、目的慢病毒載體的構(gòu)建:3種帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)篩選標(biāo)記的MCM7基因沉默重組慢病毒顆粒LV-MCM7-RNAi(23977-1),LV-MCM7-RNAi(23978-1),LV-MCM7-RNAi(23979-1)及陰性對(duì)照重組病毒 LV-NC-RNAi,構(gòu)建 MCM7 特異性shRNA重組病毒。3、3種MCM7特異性shRNA重組病毒分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。Real-time PCR分別檢測(cè)MCM7轉(zhuǎn)錄水平,篩選出靶點(diǎn)敲減效率最高的一種重組慢病毒顆粒。4、通過(guò)Real-time PCR及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后對(duì)MCM7轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)的抑制情況。5、按照重組病毒干預(yù)與否,分為L(zhǎng)V-MCM7-RNAi組、LV-NC-RNAi對(duì)照組和空白對(duì)照組。體外通過(guò)應(yīng)用FCM檢測(cè)K562細(xì)胞周期及凋亡情況。體外探討特異性抑制MCM7的表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。6、采用Real-time PCR及Western blot法進(jìn)行驗(yàn)證,找尋起關(guān)鍵作用的信號(hào)途徑,初步闡明MCM7在白血病的作用和分子機(jī)制。7、建立白血病移植瘤的動(dòng)物模型:BALB/C裸鼠隨機(jī)分為3組,建立局部移植瘤模型。每天觀察裸鼠背部移植瘤的成瘤和生長(zhǎng)情況,繪腫瘤生長(zhǎng)曲線,每4天記錄一次。8、腫瘤病理組織學(xué)檢查:取各組裸鼠的腫瘤組織Real-time PCR和Western blot檢測(cè)腫瘤標(biāo)本內(nèi)MCM7基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)。同時(shí)制作病理切片進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果:熒光顯微鏡顯示重組病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率90%, Real-time PCR及Western blot顯示LV-MCM7-RNAi組與LV-NC-RNAi組和空白對(duì)照組相比,MCM7基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào),靶點(diǎn)敲減效率分別達(dá)(92.3±1.88) %和(91.18±0.93) %。CCK8結(jié)果顯示:自第24h起,穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞的增殖與兩組對(duì)照細(xì)胞相比明顯受抑制。FCM結(jié)果顯示LV-MCM7-RNAi組較LV-NC-RNAi組和空白對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期顯著減少,M期也有小幅度減少,細(xì)胞周期被阻滯在G1期。FCM凋亡檢測(cè)LV-MCM7-RNAi組細(xì)胞凋亡率為(45.12±1.68)%,明顯高于 LV-MCM7-RNAi 組(7.96士0.85)%和空白對(duì)照組(8.37±1.02)%。Western blot 顯示 LV-MCM7-RNAi 組的 Polo-Like 激酶 1 ( PLK1)及磷酸化的PLK1(p-PLK1)均較LV-NC-RNAi組和空白對(duì)照組表達(dá)明顯下調(diào),而P73、bax基因表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型生長(zhǎng)曲線表明LV-shRNA-MCM7重組病毒組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯慢于LV-shRNA-negative對(duì)照組和空白對(duì)照組。結(jié)論:MCM7基因沉默使腫瘤細(xì)胞被阻滯在G1期,DNA無(wú)法復(fù)制,增殖受抑制。因周期阻滯作用,PLK1基因無(wú)法激活,PLK1及pPLK1蛋白表達(dá)下調(diào),從而使其對(duì)抑癌基因p73基因轉(zhuǎn)活性的抑制作用降低,p73基因及其下游基因bax表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加。第二部分重組慢病毒介導(dǎo)的MCM7基因沉默對(duì)肝癌MHCC-97H細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響目的:本研究探討應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)特異性沉默MCM7基因?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC-97H生物學(xué)效應(yīng)的影響。方法:以人MCM7編碼序列作為干擾靶點(diǎn),構(gòu)建靶向MCM7的shRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞MHCC-97H,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。按照重組病毒干預(yù)與否,分為L(zhǎng)V-MCM7-RNAi組、LV-NC-RNAi對(duì)照組和空白對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞MCM7表達(dá)的變化。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡,劃痕法檢測(cè)遷移能力改變,Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)以穿膜細(xì)胞的數(shù)量評(píng)估各組肝癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:熒光顯微鏡顯示重組病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率90%, Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示LV-MCM7-RNAi組MCM7 mRNA及蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組(LV-NC-RNAi)及空白對(duì)照組顯著降低(P0.05)。MTT結(jié)果顯示LV-MCM7-RNAi組細(xì)胞增殖速度顯著抑制(P0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示LV-MCM7-RNAi組較LV-NC-RNAi組和空白對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期顯著減少,細(xì)胞周期被阻滯在G1期。同時(shí)LV-MCM7-RNAi組的細(xì)胞凋亡率顯著增加。在MCM7基因有效沉默后,肝癌細(xì)胞MHCC-97H的侵襲及遷移能力顯著下降(P0.05)。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的shRNA能有效沉默肝癌MHCC-97H細(xì)胞MCM7基因的表達(dá),腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯于GO/G1期,并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí),MCM7基因沉默可抑制肝癌MHCC-97H細(xì)胞的體外增殖、侵襲等生物學(xué)效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：R733.7
【部分圖文】：

?ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ??Ｌ＾＾ｔｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ?＾ｉｎａｃｔｉｖｅ?＾??圖１－１：?ＭＣＭ在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用［７７］??■ｉｌｌｌｉｆ?Ｐ—??＾?ＭＣＨ７?ｇｅｎｏｍｅ?＃??／?人?？??＊?ｍｉＲ１０６ｂ－２５?ｐ２ｌ?ｍＲＮＡ??，Ｕ?＾?；？?＾??多：？：?４?＞？??ＩＩ？?？?Ｊ?Ｐ??＾?？?＾??ｚ?＿?一??＾?＾ｇｉ??圖１－２：?ＭＣＭ７致癌信號(hào)通路圖［７８］??９??

圖１－１：?ＭＣＭ在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用［７７］??Ｐ—??

圖１－３ｓｈＲＮＡ作用過(guò)程??１．２．２設(shè)計(jì)原則：??１．２．２．１克隆到ｓｈＲＮＡ表達(dá)載體中的ｓｈＲＮＡ包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由？？蓮環(huán)（ｌｏｏｐ）??序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由ｐｏｌＩＩＩ啟動(dòng)子控制。隨后在連上５－６個(gè)Ｔ作為ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ??的轉(zhuǎn)錄終止子。??１．２．２．２兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點(diǎn)。??１．２．２．３?ＳｔｒａｔａＧＥＮＥ發(fā)現(xiàn)２９個(gè)寡核苷酸較之原先推薦的２３個(gè)寡核苷酸可以更有效的抑制丨丨??的基因。??１．２．２．４在啟動(dòng)子下游的酶切位點(diǎn)下方緊連一個(gè)Ｃ，使插入片段和啟動(dòng)子有一定空間間隔以確??保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。??１．２．２．５?ｓｈＲＮＡ目的序列的第？個(gè)堿基必須是Ｇ以確保ＲＮＡ聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序??，一。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2869765