紫外光誘導(dǎo)花青素合成是植物光形態(tài)建成的一種響應(yīng),是由光受體及其信號(hào)分子共同協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示:津田蕪菁'Tsuda'的膨大肉質(zhì)根表皮花青素合成受UV-A單色光及藍(lán)光+UV-B復(fù)合光的誘導(dǎo),有哪些光受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與該過(guò)程尚不清楚。為研究非模式植物津田蕪菁對(duì)UV-A和藍(lán)光+UV-B的反應(yīng)及相關(guān)信號(hào)調(diào)控,解析蕪菁中紫外光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑,本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期所獲得的系列光不敏感型花青素合成突變體進(jìn)行了初步鑒定包括突變表型穩(wěn)定遺傳突變體的F2群體構(gòu)建及遺傳分析、花青素合成相關(guān)基因表達(dá)初步分析,高通量測(cè)序結(jié)合MutMap分析對(duì)三個(gè)目標(biāo)突變體g56w、g97w和g142w進(jìn)行候選基因初步定位,獲得以下結(jié)果:1.光不敏感型花青素合成突變體的遺傳及下游基因表達(dá)分析野生型與花青素合成相關(guān)突變體膨大肉質(zhì)根表皮見(jiàn)光及未見(jiàn)光部分的花青素含量測(cè)定揭示野生型津田蕪菁花青素合成屬光敏感型花青素合成模式,而突變體花青素合成模式則為光不敏感型花青素合成模式。突變體g56w、g83w、g97w、g140w、g141w、g142w和g143w在光照條件下無(wú)花青素合成,屬于花青素缺失突變體表型,且經(jīng)多代自交后其突變性狀穩(wěn)定遺傳。不同突變體系之間測(cè)交分析顯示,突變體之間雜交的F1代表型和野生型表型一致,推測(cè)本研究中獲得的7個(gè)花青素缺失突變體的表型為不同位點(diǎn)突變導(dǎo)致。突變體g56w、g83w、g97w、g140w、g141w、g142w、g143w和g19r與野生型蕪菁分別構(gòu)建F2群體,表型調(diào)查及F2群體中單株個(gè)體花青素含量測(cè)定分析顯示:g56w、g83w、g97w、g142w和g143w后代F2群體中,野生型表型個(gè)體與突變體表型個(gè)體分離比符合3:1,推測(cè)g56w、g83w、g97w、g142w和g143w的花青素缺失表型性狀受隱性單基因控制,花青素組成型合成突變體g19r的突變表型為單基因顯性遺傳,g140w和g141w不符合孟德?tīng)栠z傳。突變體及野生型花青素合成相關(guān)基因定量PCR分析結(jié)果顯示:與野生型相比,花青素合成缺失突變體g56w、g83w、g97w、g142w和g143w中花青素合成途徑的多數(shù)結(jié)構(gòu)基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)顯著下調(diào),如BrCHS、BrCHI、BrANS、BrDFR和BrTT8、BrPAP1等。而花青素組成型合成突變體g19r的花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及轉(zhuǎn)錄因子則為顯著上調(diào)表達(dá),因此我們推測(cè):控制突變體性狀的突變基因是非結(jié)構(gòu)基因突變導(dǎo)致的突變表型,該突變基因可能位于花青素合成途徑的上游光信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路中,從而能夠抑制光誘導(dǎo)花青素的合成或調(diào)控花青素組成型的合成。2.花青素缺失突變體g56w和g97w的突變基因初步定位利用重測(cè)序結(jié)合MutMap方法進(jìn)行突變體目標(biāo)性狀候選基因的初步定位,采用HRM技術(shù)進(jìn)行后續(xù)的候選SNP位點(diǎn)的F2群體表型連鎖分析,進(jìn)一步將g56w突變位點(diǎn)定位在A07染色體的16,825,203到17,401,586之間的區(qū)域,間距576kb。g97w突變位點(diǎn)初步定位在17,221,786到17,341,239之間區(qū)域,間距119kb,主要包括具備甲基轉(zhuǎn)移酶、跨膜受體蛋白、核苷酸結(jié)合蛋白、鋅指蛋白、蛋白激酶、蛋白質(zhì)氨基磷酸化、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶功能與活性的侯選基因。3.花青素缺失突變體g142w的突變基因定位以不同短波長(zhǎng)光質(zhì)(UV-A、藍(lán)光和藍(lán)光+UV-B)處理野生型蕪菁和突變體g142w幼苗,結(jié)果表明野生型和g142w下胚軸花青素積累模式不同,推測(cè)突變體g142w可能是我們的目標(biāo)突變體。利用HPLC比較野生型與突變體g142w中花青素類化合物的組成成分,結(jié)果顯示:突變體花青素積累量發(fā)生改變,而合成代謝途徑尚未發(fā)現(xiàn)變化。利用重測(cè)序結(jié)合MutMap方法進(jìn)行突變基因定位,候選基因定位在A07號(hào)染色體的16.0Mb-18.0Mb區(qū)域內(nèi),同時(shí)利用HRM技術(shù)進(jìn)行候選SNP的F2群體表型連鎖分析,進(jìn)一步將突變位點(diǎn)定位在A07染色體的16,902,778到17,061,871區(qū)域,間距159kb,結(jié)合SNP index0.8進(jìn)行候選基因篩選后,該區(qū)間內(nèi)包括聚半乳糖醛酸酶、�；d體蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、受體激酶、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子等8個(gè)功能基因。利用RNA-seq結(jié)合定量PCR數(shù)據(jù)分析推測(cè)Bra004121、Br029和Bra004136基因可能為候選基因。以上結(jié)果表明我們所獲得的突變體g56w、g97w和g142w均具有花青素合成非敏感型的特性,因此,控制這一突變性狀的候選基因可能參與依光型花青素合成的生物過(guò)程,這為深入分析UV-A和藍(lán)光+UV-B誘導(dǎo)的植物花青素合成途徑奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S631.3
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 植物中花青素合成及調(diào)控研究
        1.2.1 花青素的結(jié)構(gòu)及種類
        1.2.2 參與花青素合成的結(jié)構(gòu)基因
        1.2.3 花青素合成途徑相關(guān)調(diào)節(jié)基因
        1.2.4 花青素合成影響因素研究進(jìn)展
    1.3 光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響植物發(fā)育進(jìn)程的研究進(jìn)展
        1.3.1 光敏色素受體及其介導(dǎo)的紅光、遠(yuǎn)紅光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.3.2 隱花色素受體及其介導(dǎo)的藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.3.3 趨光素受體及其介導(dǎo)的藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.3.4 Zeitlupe類受體及其介導(dǎo)的藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.3.5 UV-B受體及其介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.3.6 植物光受體介導(dǎo)的花青素合成的研究進(jìn)展
    1.4 MBS （mapping-by-sequencing）研究進(jìn)展
    1.5 HRM技術(shù)及其應(yīng)用
        1.5.1 HRM技術(shù)的原理
        1.5.2 HRM技術(shù)的特點(diǎn)
        1.5.3 HRM技術(shù)在目標(biāo)基因定位中的應(yīng)用
    1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用
    1.7 本研究的目的及意義
2 光不敏感型花青素合成突變體的遺傳及下游基因表達(dá)分析
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)條件
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 野生型津田蕪菁生育動(dòng)態(tài)調(diào)查
        2.3.2 花青素合成相關(guān)突變體表型分析
        2.3.3 野生型和突變體花青素含量測(cè)定分析
        2.3.4 突變體之間的雜交后代表型調(diào)查
2的構(gòu)建及遺傳分析'>        2.3.5 突變體與野生型津田蕪菁群體F₂的構(gòu)建及遺傳分析
        2.3.6 花青素合成途徑基因表達(dá)分析
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
3 花青素缺失突變體g56w和g97w候選突變基因初步定位
    3.1 引言
    3.2 材料方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.3 結(jié)果分析
2群體中突變型后代池和野生型親本的DNA提取及高通量測(cè)序'>        3.3.1 突變體的F₂群體中突變型后代池和野生型親本的DNA提取及高通量測(cè)序
        3.3.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及數(shù)據(jù)分析
        3.3.3 MutMap分析
        3.3.4 花青素缺失突變體g56w基因定位
        3.3.5 花青素缺失突變體g97w基因定位
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
4 花青素缺失突變體g142w的突變基因定位
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)光源
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        4.2.4 實(shí)驗(yàn)方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 不同短波長(zhǎng)光質(zhì)對(duì)野生型津田蕪菁與突變體g142w的幼苗花青素合成模式分析
        4.3.2 HPLC分析野生型津田蕪菁與突變體g142w中花青素類化合物組成成分
2g142w群體的構(gòu)建及遺傳分析'>        4.3.3 突變體F₂g142w群體的構(gòu)建及遺傳分析
        4.3.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及數(shù)據(jù)分析
        4.3.5 MutMap分析
        4.3.6 突變候選基因注釋
        4.3.7 HRM技術(shù)驗(yàn)證候選SNP位點(diǎn)
        4.3.8 基于SNP的CAPs標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
        4.3.9 篩選鑒定的候選基因功能注釋
        4.3.10 候選基因區(qū)域轉(zhuǎn)錄FPKM表達(dá)值（來(lái)自轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq數(shù)據(jù)）及RT-qPCR分析
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附件

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2851765