大麥穗軸、棱型和皮裸性3個關(guān)鍵穗部性狀變化是大麥栽培馴化過程中的重大進化事件。穗軸由脆穗轉(zhuǎn)變?yōu)閳运胧且吧篼溑c栽培大麥的分界點,二棱轉(zhuǎn)變?yōu)榱怙@著提高了產(chǎn)量,而種子從有稃轉(zhuǎn)變成裸粒更加方便食用。本研究主要以中國大麥為實驗材料,對與大麥馴化栽培有關(guān)的重要穗部性狀功能基因,包括脆穗(HvBtr1和HvBtr2)、棱型(HvVrs1和HvInt-c)、皮裸(HvNud)等3個性狀共5個基因,進行了基因全長重測序比較、單倍型及其表型相關(guān)性、系統(tǒng)進化和生態(tài)地理分布等分析,探討了各個穗部性狀馴化基因的遺傳作用機制和中國栽培大麥的起源馴化與傳播途徑。主要結(jié)果和結(jié)論如下:一、大麥脆穗基因1.HvBtr1和HvBtr2全長重測序分析發(fā)現(xiàn),兩基因都存在大量等位變異,但編碼區(qū)比較保守。在398份世界各地的大麥中,發(fā)現(xiàn)41個HvBtr1等位變異,構(gòu)成11種單倍型,其中2個主要單倍型是Btr1.1a和btr1.4a,出現(xiàn)頻率分別為70.9%和24.8%。發(fā)現(xiàn)22個HvBtr2等位變異,14種單倍型,主要單倍型Btr2.3a和btr2.1a,出現(xiàn)頻率分別為51.5%和36.7%。2.野生大麥都同時攜帶2個顯性脆穗基因HvBtr1和HvBtr2,未發(fā)生1 bp或11 bp的缺失。栽培大麥只帶有其中任1個堅穗隱性Hvbtr1或Hvbtr2,發(fā)生1 bp或11 bp的缺失,不存在雙隱性基因突變或雜交重組類型。3.明確了HvBtr1和HvBtr2單倍型的世界分布,以及在中國大麥不同種質(zhì)資源類型和各個生態(tài)區(qū)的分布。發(fā)現(xiàn)HvBtr1和HvBtr2單倍型明顯分為2大組群,呈現(xiàn)明顯的東西方分布。中亞和中國等東亞國家的栽培大麥主要攜帶btr2單倍型組群,西南亞和歐美等國家以btr1組群為主。研究支持栽培大麥東西方獨立起源馴化的觀點。4.揭示了HvBtr1和HvBtr2單倍型之間的遺傳親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化路徑。根據(jù)中國野生大麥少部分與中東新月沃地野生大麥,大部分與中國六棱栽培大麥的遺傳關(guān)系最近,并結(jié)合中國野生大麥與栽培大麥農(nóng)田共生的現(xiàn)狀,提出了中國栽培大麥馴化起源的4個歷史階段:(Ⅰ)原始祖先野生二棱大麥(H.vulgare ssp.spontaneum)首先傳入青藏高原及其周邊地區(qū);(Ⅱ)野生脆穗六棱大麥(H.vulgare ssp.agriocrithon)自然突變和人工選擇;(Ⅲ)堅穗六棱大麥自然突變和人工選擇,產(chǎn)生中國原始栽培大麥;(Ⅳ)堅穗六棱與野生二棱大麥自然雜交,產(chǎn)生堅穗二棱大麥。5.中國個別地方品種為Hvbtr1單倍型,根據(jù)品種名稱和來源地推斷屬于較早從西方引進。現(xiàn)代育成品種中的btr1類型是通過與國外品種雜交引入。根據(jù)育成品種中btr1和btr2類型接近1:1,確認這2種單倍型并不影響大麥的生態(tài)適應(yīng)性。二、大麥棱型基因1.519份中國大麥,包括71份野生、445份地方品種和3份誘導突變體中,共鑒定出15種HvVrs1和7種HvInt-c單倍型。其中6個HvVrs1單倍型是本研究最新發(fā)現(xiàn),分別為Vrs1.1c、Vrs1.1d、vrs1.2d、Vrs1.2e、Vrs1.4b和vrs1.5b。2.廣泛存在于地中海地區(qū),由Vrs1第二外顯子單堿基插入產(chǎn)生的單倍型vrs1.a2,在中國大麥中可能并不存在。從來自中國黑龍江的大麥品種哈鐵系1號及其EMS六棱突變體中,發(fā)現(xiàn)2種單倍型Vrs1.5a和vrs1.5b,分別是對二棱基因HvVrs1遺傳效應(yīng)增強和抑制作用最大的等位基因。Vrs1.5a為Vrs1的A1333G單堿基錯義突變,側(cè)小穗完全退化;突變基因vrs1.5a是由于編碼區(qū)末端SNP變異形成終止密碼子,導致翻譯提前終止和編碼蛋白VRS1.5a減少4個氨基酸殘基,側(cè)小穗發(fā)育結(jié)實正常,由完全退化二棱轉(zhuǎn)變?yōu)榱獯篼湣?.明確了HvVrs1和HvInt-c主要單倍型在大麥生態(tài)區(qū)和種質(zhì)資源類型中的分布。中國大麥中,HvVrs1主要存在3種單倍型,分別是Vrs1.1a、vrs1.2和Vrs1.4a;HvInt-c主要有2種,為Int-c.1a和int-c.2a。其中,Vrs1.1a、Vrs1.4a和Int-c.1a在青藏高原及周邊地區(qū)野生和栽培大麥出現(xiàn)頻率最高,vrs1.2和int-c.2a在西北、黃淮和長江中下游冬大麥區(qū)分布最多。4.明確了HvVrs1和HvInt-c單倍型組合基因型對應(yīng)的不同棱型表現(xiàn)。HvInt-c.的全部單倍型與Vrs1.1a組成的所有基因型都表現(xiàn)為二棱,與vrs1.2的全部為六棱。但與Vrs1.4a組成的基因型,卻表現(xiàn)出二棱、六棱和中間型各種不同的穗型,且其中的地方品種全是六棱。認為地方品種的六棱穗型來源于人工選擇,而野生大麥的棱型表現(xiàn)是不同棱型祖先雜交后,在未經(jīng)選擇的情況下,不同位點的棱型基因長期不斷分離和純合穩(wěn)定的結(jié)果。揭示HvVrs1和HvInt-c并不能完全決定棱型表現(xiàn),中國大麥中還存在著另一個未知的非等位互作基因。5.Vrs1單倍型系統(tǒng)進化中介網(wǎng)絡(luò)顯示,中國大麥3個主要單倍型,Vrs1.1a和vrs1.2直接來源于共同的未知祖先Mv1,而Vrs1.4a是之后從Mv1經(jīng)過另一未知祖先Mv2演化而來。如果假設(shè)未知祖先為中國青藏高原及其周邊最早引進的原始二棱野生大麥,結(jié)合攜帶Vrs1.4a/Int-c基因型中國野生大麥的棱型表現(xiàn),剛好與本研究根據(jù)大麥脆穗性基因HvBtr1和HvBtr2的系統(tǒng)遺傳進化,提出的中國大麥的來源和栽培馴化起源的4個階段基本吻合。三、大麥皮裸性基因1.鑒定發(fā)現(xiàn)7份裸大麥HvNud基因不存在17 kb區(qū)段缺失,認為編碼區(qū)17 kb區(qū)段缺失并不是發(fā)生裸粒突變的唯一途徑。以往研究證實,大麥從種子帶皮轉(zhuǎn)變成裸粒,是由于包含HvNud完整基因區(qū)段發(fā)生了17 kb區(qū)段缺失。本研究對519份中國大麥的HvNud基因位點,進行了17 kb缺失區(qū)段PCR檢測。結(jié)果顯示,所有皮大麥都沒有發(fā)生17 kb的缺失,絕大多數(shù)裸大麥都缺失了17 kb區(qū)段,但有7份來源于西藏的裸大麥并無17 kb的缺失。2.研究發(fā)現(xiàn)HvNud新單倍型和裸大麥突變馴化新途徑。將上述7份西藏裸大麥與篩選的40份種子脫殼程度存在差異的皮大麥進行HvNud基因全長重測序分析。共鑒定出4個等位變異、5種單倍型H1-H5,其中H3、H4和H5是本研究最新發(fā)現(xiàn)。單倍型H1為正常皮大麥,H2為本研究鑒定發(fā)現(xiàn)的7份西藏裸大麥,HvNud基因編碼區(qū)mm結(jié)構(gòu)域內(nèi)右側(cè)堿基發(fā)生SNP錯義突變,引起NUD蛋白148位的纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?致使脂質(zhì)粘合劑合成受阻。H3是在內(nèi)含子區(qū)域的變異;H5是在mm結(jié)構(gòu)域內(nèi)左側(cè)堿基發(fā)生SNP錯義突變;H4是在H3突變基礎(chǔ)上,又在mm和cm結(jié)構(gòu)域之間區(qū)段發(fā)生6 bp堿基缺失。H4和H5表現(xiàn)為半裸或不完全裸粒。由此可見,mm結(jié)構(gòu)域內(nèi)不同位點的變異不同程度的影響HvNud基因的功能;mm結(jié)構(gòu)域之外發(fā)生寡或多堿基缺失同樣可使Nud基因的功能降低。3.根據(jù)Nud等位基因的核苷酸變異,推測出5種單倍型之間的遺傳進化關(guān)系。H1為原始單倍型,H2、H3和H5是H1不同堿基位點的SNP突變后代,H4是H3進一步發(fā)生6 bp堿基缺失后代。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S512.3
【部分圖文】：

圖 1.1 大麥穗棱型變異示意圖（Koppolu et al., 2013）Fig 1.1 Spike morphology of different mutants in barley和栽培二棱大麥均含有 Vrs1 顯性等位基因，六棱栽培大麥含有 vrs1et al., 1999）（圖 1.1A-B）。Komatsuda 等通過定位克隆分離出大麥 v因 vrs1 控制，位于染色體 2HL，野生型 Vrs1 等位基因編碼 I 類同源eodomain-leucine zipper motif，HD-ZIP），抑制側(cè)小穗發(fā)育（Komatsud RNA 原位雜交表明，Vrs1 基因在兩側(cè)小穗特異表達，而不在中央小一步證實了 Vrs1 基因有抑制側(cè)小穗發(fā)育功能。六棱基因 vrs1 的序列獨立起源形式。其中兩個等位基因（vrs1.a2 和 vrs1.a3）分別是直接麥的 Vrs1.b2 和 Vrs1.b3 基因，發(fā)生單堿基突變而引起移碼和反義替換布最為普遍，可能是第一個出現(xiàn)的六棱等位突變基因。Vrs1 基因起源ox2 的復制，而且可能為大麥屬所特有，在小麥族其他屬種并不存在已對不同地區(qū)大麥開展了大麥 vrs1 基因的重測序，Vrs1.p 與尖形芒b 關(guān)聯(lián)鈍稃形側(cè)小穗，而 Vrs1.t 則導致側(cè)小穗完全退化（Saisho et al., 些 Vrs1 等位基因在 DNA 水平上表現(xiàn)出變異，但是它們的調(diào)控機制然不清楚（Saisho et al., 2009）。通過對易變大麥（labile-barley）Vrs1

13圖 2.1 大麥 HvBtr1 和 HvBtr2 基因等位變異及其單倍型注：紅色字體，關(guān)鍵功能變異；“-”表示 Indels。核苷酸序列與 Btr1.1a 或 Btr2.1a 相同則標注為點。Fig 2.1 The allelic variation and haplotypes of HvBtr1 (A) and HvBtr2 (B) in barley accessions.Note: red, the key functional variations; “-” indicated Indels. The nucleotide sequences identical to Btr1.1a or Btr2.1a are showed as dots.對 398 份來源于世界各地的大麥種質(zhì)，進行脆穗基因 Btr1 和 Btr2 全長測序，分析其單倍型。首先剔除測序結(jié)果中前后兩端峰值較差的部分，拼接獲得基因全長，最終序列包括 5 側(cè)翼區(qū) 1408bp，基因編碼區(qū) 591 bp 及 3 側(cè)翼區(qū) 551 bp，共 2550 bp。序列分析發(fā)現(xiàn)，Btr1 序列區(qū)域自然變異最為豐富，上述三個區(qū)域分別含有 25、6 和 10 個變異位點（圖 2.1A）。在這 41 個等位變異位點中，8 個位點 SNP-4、SNP-12、InDel-3、SNP-29、SNP-32、SNP-33、SNP-34 以及 SNP-35 僅各在一份材料中被發(fā)現(xiàn)，屬于稀有等位變異（頻率小于 1%）；SNP-18 在 7 份材料中發(fā)現(xiàn)，為低

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第二章 基于大麥脆穗基因重測序的中國大麥起源馴化研究Btr1.1a/btr2.3b 包含的全部 21 份中國地方品種均為六棱大麥；Btr1.1a/br2.3a 不僅包括二棱大麥，也有六棱地方品種和育成品種。類群 b 的 3 個主亞群也分別由 3 種主要單倍型 Btr1.2/Btr2.1a，Btr1.3/Btr2.2 和 btr1.4a/Br2.1a為代表。Btr1.2/Btr2.1a 包含的全部 7 份材料都為中國野生大麥，其中 3 份為二棱，4 份是六棱大麥。Btr1.3/Btr2.2 是唯一的一份來源于埃及的二棱野生大麥。btr1.4a/Br2.1a 的 89 份大麥種質(zhì)大部分來自西方，既有二棱也有六棱（圖 2.2A）。
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本文編號：2847009