胺氧化酶(amine oxidase)主要參與生物體內(nèi)胺類物質(zhì)的代謝過程,對維持生物體的神經(jīng)傳導(dǎo)、新陳代謝和細(xì)胞的生長分化等具有重要的調(diào)節(jié)作用。常見的胺氧化酶有以醌為輔因子的含銅的二胺氧化酶和伯胺氧化酶,以黃素為輔因子的單胺氧化酶;多胺氧化酶有乙酰多胺氧化酶和精胺氧化酶。單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)廣泛存在于生物機(jī)體各組織中,主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)組織的線粒體外膜及突觸前膜,是一種黃素蛋白酶�；趯Φ孜锖鸵种苿┑倪x擇性和敏感性的差異,MAO被分為MAO-A和MAO-B兩種亞型,并由位于X染色體上的不同的基因編碼。MAO-A對5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺具有高親和力,并且可被氯吉蘭特異性抑制;MAO-B對底物苯乙胺、芐胺和色胺具有較強(qiáng)的親和力,并可被司來吉蘭所抑制。此外,有大量研究表明,MAO與哺乳動物的攻擊性行為和人類的反社會行為密切相關(guān)。精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)作為一種近期被發(fā)現(xiàn)的多胺氧化酶,能夠不經(jīng)過乙�；倪^程直接氧化分解精胺產(chǎn)生亞精胺、苯基丙醛和活性氧H_2O_2。多胺通過與細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)、受體蛋白以及胞膜上的識別分子結(jié)合,對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起到調(diào)節(jié)的作用。近期SMO研究的熱點(diǎn)集中在其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與腫瘤之間的關(guān)系。擬穴青蟹(Scylla paramamosain)多分布于熱帶或亞熱帶的近海河口區(qū)域,是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類。本研究擬穴青蟹為研究對象,并成功構(gòu)建了擬穴青蟹的cDNA文庫,然后利用RACE技術(shù)克隆出目的基因的cDNA序列全長,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。選擇單胺氧化酶典型抑制劑槲皮素處理實(shí)驗蟹,利用實(shí)時定量PCR技術(shù)對擬穴青蟹胺氧化酶基因在不同濃度槲皮素抑制下的表達(dá)模式。構(gòu)建擬穴青蟹pCold-Ⅰ-SpAMO重組表達(dá)質(zhì)粒,使之在表達(dá)菌株大腸桿菌中高效表達(dá),最后對得到的重組蛋白進(jìn)行功能驗證�，F(xiàn)對本文主要研究結(jié)果總結(jié)如下:1.通過RACE法成功克隆得到了擬穴青蟹的胺氧化酶基因的cDNA序列全長,綜合分析后命名為:SpAMO。NCBI在線比對結(jié)果顯示其與其他物種的SMO基因擁有較高的相似性。SpAMO基因cDNA全長為2599 bp,它包含一個1521 bp的開放閱讀框(ORF),一個26 bp的5’-末端非編碼區(qū)域,一個1052 bp的3’-末端非編碼區(qū)域,共編碼了506個氨基酸。氨基酸序列的前26個殘基為信號肽區(qū)域,在poly-A上游11bp處發(fā)現(xiàn)了一個多聚的腺苷酸信號(AATAAA),此為終止信號;在SpAMO基因的3’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多個與轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性相關(guān)的ATTTA(G)基序。預(yù)測的蛋白分子量為56.96 kDa,理論等電點(diǎn)5.04。SpAMO含有一個保守的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域,另外三個保守區(qū)域為PLN0568、YobN和proto_IX_ox。系統(tǒng)進(jìn)化分析揭示擬穴青蟹SpAMO與SMO聚集在一起,并與昆蟲形成無脊椎動物的一支。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示SpAMO以家鼠過氧化物N(1)-乙�；�-精胺/亞精胺的三級結(jié)構(gòu)為模型,相似度為28.25%;且兩者的FAD結(jié)合域三級結(jié)構(gòu)高度相似,均包含一個α-螺旋和兩個延伸主鏈。2.qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),通過體外注射槲皮素能夠抑制SpAMO的轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)注射劑量為5 mg/kg/d時,SpAMO的轉(zhuǎn)錄水平呈波動的趨勢變化,在起初的24 h內(nèi)兩種組織中表達(dá)量均下降,隨后的2 d表達(dá)量顯著上升,再接下來的2 d表達(dá)量再次下降,抑制效果要強(qiáng)于前24 h的水平,并且槲皮素對腦組織中SpAMO的抑制作用要強(qiáng)于血淋巴。槲皮素易于自動氧化,抑制的可逆性和對SpAMO弱抑制作用可能是波動變化的原因。當(dāng)注射劑量為50 mg/kg/d時,抑制作用更顯著,血淋巴和腦組織中的SpAMO基因的表達(dá)水平下降至原始水平的10%左右,并且SpAMO的表達(dá)量穩(wěn)定在一個低水平,而且血淋巴中mRNA含量降低更顯著。3.通過構(gòu)建擬穴青蟹pCold-Ⅰ-SpAMO重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株,對獲得的重組蛋白SpAMO進(jìn)行鑒定、純化、復(fù)性和功能驗證�？芍�,SpAMO與四種底物均可以通過氧化脫氨作用生成活性氧(H_2O_2),四種底物的平均熒光值分別為18.4、12.8、1.3和1.4�？芍猄pAMO對5-HT和多巴胺的氧化脫氨基作用明顯強(qiáng)于精胺和苯乙胺,即SpAMO蛋白對5-HT和多巴胺的酶活性強(qiáng)于精胺和苯乙胺。所以,能夠推斷SpAMO在擬穴青蟹體內(nèi)主要起催化5-HT和多巴胺的功能。綜上所述,通過對本研究克隆得到的擬穴青蟹SpAMO基因cDNA全序列進(jìn)行的生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示SpAMO具有更多的精胺氧化酶(SMO)的分子特征,但是抑制劑實(shí)驗和酶活性研究表明其也具有單胺氧化酶A(MAO-A)的功能。所以,我們推測SpAMO可能是一種特殊形式的胺氧化酶,它在擬穴青蟹體內(nèi)共同承擔(dān)了SMO和MAO-A的生物學(xué)功能。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 單胺氧化酶的催化底物Fig.1-1 The substrates catalyzed by monoamine oxidase.圖 1-2 MAO-A 抑制劑氯吉蘭和 MAO-B 抑制劑司來吉蘭Fig. 1-2 The inhibitors of clorgyline for MAO-A and selegiline for MAO-B等哺乳動物中，單胺氧化酶 A（MAO-A）和單胺氧化酶 B（M因編碼，并且位于 X 染色體上，介于 Xp11.23-11.4 連鎖區(qū)域化酶 A 基因和 B 基因的克隆清楚的顯示兩種基因在序列上的析其 mRNA 大小分別是 4.5-5.4 kb 和 2.8-3.1 kb，外顯子均為的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，兩者間有 70%的同源性[28]；其主要區(qū)

圖 1-2 MAO-A 抑制劑氯吉蘭和 MAO-B 抑制劑司來吉蘭ig. 1-2 The inhibitors of clorgyline for MAO-A and selegiline for MAO哺乳動物中，單胺氧化酶 A（MAO-A）和單胺氧化酶 B（編碼，并且位于 X 染色體上，介于 Xp11.23-11.4 連鎖區(qū)酶 A 基因和 B 基因的克隆清楚的顯示兩種基因在序列上其 mRNA 大小分別是 4.5-5.4 kb 和 2.8-3.1 kb，外顯子均內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，兩者間有 70%的同源性[28]；其主要同，單胺氧化酶 A 的核心啟動子是 SP1 的結(jié)合位點(diǎn)，可化酶 B 為兩個 SP1 位點(diǎn)，可通過疊加效應(yīng)激活該啟動子明，MAO-A 和 MAO-B 的基因有可能來源于同一個祖先[3馬魚 MAO 的研究，闡述了所有物種 MAO 均含有三個結(jié)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域[31]。通過氨基酸序列 Z-MAO 與鮭魚的 T-MAO 相似性為 84%，同人和鼠等哺 %，在人和鼠等多種哺乳類動物中 MAO-A 和 MAO-B 具

圖 1-3 人類 MAO-A 完整的結(jié)構(gòu)[34]Fig. 1-3 Overall structure of human MAO-A機(jī)理相關(guān)研究表明，氨基酸殘基 His382 和性過程中起著非常重要的作用，A型單胺氧的 Ile199 與底物的特異性起決定作用[35]中心也存在半胱氨酸殘基，猜測該殘基同時酶的輔酶，黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD） 的 Cys397 以共價鍵結(jié)合，定點(diǎn)突變實(shí)驗AO-B 催化相關(guān)，同樣揭示了其他比較重要 和 Arg42，這些殘基與 FAD 以非共價的形38]。關(guān)于單胺氧化酶的催化機(jī)制，目前已知移途徑（Single electron transfer pathway, Sgen atom transfer pathway, HAT）,第三是
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本文編號：2846417