為初步探究蛹蟲草對(duì)亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,確定參與亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白和調(diào)控機(jī)制,本研究分別通過以下實(shí)驗(yàn),不同pH值、亞硒酸鹽濃度對(duì)蛹蟲草硒吸收的影響實(shí)驗(yàn)、蛹蟲草硒吸收過程中產(chǎn)生的單質(zhì)硒的電鏡觀察、蛹蟲草吸收亞硒酸鹽的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和比較不同抑制劑下蛹蟲草對(duì)硒吸收的差異,探究不同情況下硒可能的運(yùn)輸途徑,并通過生物信息學(xué)的的方法,從蛋白數(shù)據(jù)庫中比對(duì)出可能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因,再通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同條件下轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相應(yīng)的m RNA表達(dá)量變化,綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果從多方面分析驗(yàn)證,探究出蛹蟲草吸收亞硒酸鹽過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下:1.不同亞硒酸鹽形態(tài)(pH值)和濃度對(duì)蛹蟲草硒轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的影響。本研究通過生物量、硒吸收總量、單位質(zhì)量含硒量角度,富硒效率等富硒指標(biāo),經(jīng)因素分析篩選出基礎(chǔ)、簡(jiǎn)化和穩(wěn)定的富硒優(yōu)化條件,培養(yǎng)液pH值為8,亞硒酸鹽濃度為30 mg/L蛹蟲草富硒條件最優(yōu),生物量平均2.067×10~3 mg/L,硒吸收總量為平均為2.715 mg,單位富硒量10.756 mg/g,此時(shí)富硒效率約90%。通過單因素和雙因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中存在對(duì)不同形態(tài)的亞硒酸鹽具有特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,得證不同亞硒酸鹽形態(tài)(SeO_3~(2-),HSeO_3~-,H_2SeO_3)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親和性不同,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)SeO_3~(2-)(pH=8)的親和性HSeO_3~-(pH=5)的親和性H_2SeO_3(pH=5)的親和性。此外水溶液中亞硒酸鹽的不同離子形態(tài),其在分子質(zhì)量、分子極性、所帶電荷數(shù)、空間結(jié)構(gòu)等方面都存在差異,在一定程度上可以被認(rèn)為不同物質(zhì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)不同亞硒酸鹽形態(tài)存在對(duì)蛹蟲草轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有激活和調(diào)控作用。2.不同亞硒酸鹽形態(tài)(pH值)和濃度對(duì)蛹蟲草產(chǎn)生單質(zhì)硒的影響。蛹蟲草菌絲在富硒培養(yǎng)的過程中,類似某些微生物會(huì)出現(xiàn)―紅硒現(xiàn)象‖,會(huì)有納米級(jí)單質(zhì)硒出現(xiàn),本研究利用該原理進(jìn)行電鏡觀察。同一pH=5條件下,設(shè)置不同亞硒酸鹽濃度梯度,硒濃度范圍為20 mg/L～200 mg/L,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單質(zhì)硒主要在胞內(nèi)產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)蛹蟲草對(duì)亞硒酸鹽的吸收和同化的存在飽和現(xiàn)象。而在同一亞硒酸鹽濃度條件(25 mg/L)不同pH值條件下(pH=3,5,8),經(jīng)富硒培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲,不同pH值處理的菌絲單質(zhì)硒顆粒數(shù)量存在顯著差異,在一定程度上也說明了不同pH值條件下的不同形態(tài)的亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)效率或途徑存在差異,其中pH=3時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)效率和胞內(nèi)硒含量最低。3、蛹蟲硒轉(zhuǎn)運(yùn)途徑動(dòng)力學(xué)特征。pH=3條件下,蛹蟲草吸收亞硒酸鹽在的線性方程是y=0.002917x+0.02509,決定系數(shù)R~2=0.9492;pH=5條件下,蛹蟲草的亞硒酸鹽吸收量-濃度擬合曲線是非線性的,Km=76.92mg L~(-1) h-1mg~(-1),Vm=0.8986決定系數(shù)R~2=0.8986。pH=8條件下的蛹蟲草的線性方程是y=0.007752x+0.02506,決定系數(shù)R~2=0.8454而pH=8的米氏方程擬合,其決定系數(shù)R~2為0.8422,結(jié)果表明H_2SeO_3運(yùn)輸以被動(dòng)運(yùn)輸為主,HSeO_3~-運(yùn)輸以主動(dòng)運(yùn)輸為主,而SeO_3~(2-)運(yùn)輸則可能為主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)運(yùn)輸同時(shí)作用。通過亞硒酸鹽動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和電鏡觀察結(jié)果,確定蛹蟲草存在多種對(duì)不同形態(tài)的亞硒酸鹽(SeO_3~(2-),HSeO_3~-,H_2SeO_3)存在親和性差異的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。4、利用抑制劑探究蛹蟲草中硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。利用水通道蛋白抑制劑和陰離子通道蛋白的抑制劑在不同pH條件下,對(duì)蛹蟲草吸收不同形態(tài)的亞硒酸鹽進(jìn)行抑制,結(jié)果證明水通道蛋白是蛹蟲草中參與亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體,并發(fā)現(xiàn)SeO_3~(2-),HSeO_3~-主要通過體積敏感的陰離子通道進(jìn)入蛹蟲草菌絲。利用磷酸鹽和硫酸鹽在不同pH條件下,對(duì)蛹蟲草吸收不同形態(tài)的亞硒酸鹽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在pH=3時(shí),高磷和低磷條件處理,低磷處理后抑制率達(dá)到40%,高磷處理后抑制率達(dá)到51%,pH=8時(shí),高磷處理后蛹蟲草吸收亞硒酸鹽的含量不存在顯著性差異,低磷處理后抑制率可達(dá)14%;pH=8時(shí)低硫處理后抑制率可達(dá)到42%,高硫處理后抑制率可達(dá)19.5%。pH=5時(shí)低硫和低磷共處理后抑制率可達(dá)到27%,而單一添加磷酸鹽或硫酸鹽在pH=5條件下無抑制現(xiàn)象。結(jié)果可以確定蛹蟲草吸收鹽硒酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)共用磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,轉(zhuǎn)運(yùn)效率與亞硒酸鹽的形態(tài)有關(guān)。5、蛹蟲草中硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)信息和探究其調(diào)控機(jī)制。應(yīng)用生物信息學(xué)方法,根據(jù)文獻(xiàn)選用Os NIP2:1(硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)子)、pho84、pho89(磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子)、SUL2(硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)子)和蛹蟲草蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白序列比對(duì),選出蛹蟲草中的硫酸轉(zhuǎn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并結(jié)合作物栽培學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件,通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)量,篩選出可靠的硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因如下:Os NIP2:1-analogue的CCM_00972,Pho84-analogue的CCM_09308,Su L2-analogue的CCM_00881。最后再通過設(shè)計(jì)不同的培育條件對(duì)硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白m RNA水平的調(diào)控實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中水通道蛋白的基因受亞硒酸鹽形態(tài)和濃度的調(diào)控,而磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因則受pH值、亞硒酸鹽形態(tài)和濃度的調(diào)控,硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則可能具有與釀酒酵母中SUL2相同的(硫酸鹽)使用依賴失活機(jī)制。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.3
【部分圖文】：

H+濃度和亞硒酸鹽形態(tài)以 H2SeO3為主的情況下，蛹蟲草對(duì)亞硒酸鹽（H2SeO3）的吸效率較低。由圖 1(c)可知，培養(yǎng)液中亞硒酸鹽濃度為 60 mg/L，不同 pH 處理的蟲草菌絲體的位質(zhì)量含硒量不存在顯著差異（p>0.05），此時(shí) pH 值對(duì)蛹蟲草單位質(zhì)量的硒含量并無響。由圖 1(d)可知，培養(yǎng)液中亞硒酸鹽濃度為 60 mg/L 條件下，pH=5 條件處理菌絲硒效率遠(yuǎn)高于 pH=3 條件處理，兩者之間存在顯著差異（p<0.05）；而 pH=8 條件處理pH=5 處理沒有顯著差異（p>0.05）。pH=3 處理的硒吸收效率較低。再次說明在溶液較高的 H+濃度和亞硒酸鹽形態(tài)以 H2SeO3為主的情況下，蛹蟲草對(duì)亞硒酸鹽（H2SeO的吸收效率較低。

由圖 2（d）可知，在富硒培養(yǎng)過程中，蛹蟲草的富硒效率，隨培養(yǎng)液中亞硒酸鹽的濃度的增加逐漸降低。其中培養(yǎng)液中亞硒酸鹽濃度為 15mg/L 和 30mg/L 條件下，蛹蟲草富硒效率較高，兩者之間不存在顯著差異（p>0.05）平均約 87.279%，而與其它較高的亞硒酸鹽濃度條件下的富硒率相比都存在顯著差異（p<0.05）。

、亞硒酸鹽濃度對(duì)蛹蟲草單質(zhì)硒析出的影響質(zhì)硒主要在蛹蟲草菌絲體的胞內(nèi)出現(xiàn)，是由亞硒酸鹽轉(zhuǎn)該現(xiàn)象在亞硒酸鹽培育富硒蛹蟲草的過程中出現(xiàn)，是蛹到飽和后而出現(xiàn)的一種保護(hù)機(jī)制。
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本文編號(hào)：2846404