為初步探究蛹蟲草對亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)運途徑,確定參與亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運的蛋白和調(diào)控機制,本研究分別通過以下實驗,不同pH值、亞硒酸鹽濃度對蛹蟲草硒吸收的影響實驗、蛹蟲草硒吸收過程中產(chǎn)生的單質(zhì)硒的電鏡觀察、蛹蟲草吸收亞硒酸鹽的動力學實驗和比較不同抑制劑下蛹蟲草對硒吸收的差異,探究不同情況下硒可能的運輸途徑,并通過生物信息學的的方法,從蛋白數(shù)據(jù)庫中比對出可能的轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因,再通過實驗驗證不同條件下轉(zhuǎn)運蛋白相應的m RNA表達量變化,綜合以上實驗結(jié)果從多方面分析驗證,探究出蛹蟲草吸收亞硒酸鹽過程中的調(diào)節(jié)機制。主要的研究結(jié)果如下:1.不同亞硒酸鹽形態(tài)(pH值)和濃度對蛹蟲草硒轉(zhuǎn)運途徑的影響。本研究通過生物量、硒吸收總量、單位質(zhì)量含硒量角度,富硒效率等富硒指標,經(jīng)因素分析篩選出基礎、簡化和穩(wěn)定的富硒優(yōu)化條件,培養(yǎng)液pH值為8,亞硒酸鹽濃度為30 mg/L蛹蟲草富硒條件最優(yōu),生物量平均2.067×10~3 mg/L,硒吸收總量為平均為2.715 mg,單位富硒量10.756 mg/g,此時富硒效率約90%。通過單因素和雙因素實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中存在對不同形態(tài)的亞硒酸鹽具有特異性的轉(zhuǎn)運途徑,得證不同亞硒酸鹽形態(tài)(SeO_3~(2-),HSeO_3~-,H_2SeO_3)對轉(zhuǎn)運蛋白親和性不同,轉(zhuǎn)運蛋白對SeO_3~(2-)(pH=8)的親和性HSeO_3~-(pH=5)的親和性H_2SeO_3(pH=5)的親和性。此外水溶液中亞硒酸鹽的不同離子形態(tài),其在分子質(zhì)量、分子極性、所帶電荷數(shù)、空間結(jié)構(gòu)等方面都存在差異,在一定程度上可以被認為不同物質(zhì),實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)不同亞硒酸鹽形態(tài)存在對蛹蟲草轉(zhuǎn)運蛋白具有激活和調(diào)控作用。2.不同亞硒酸鹽形態(tài)(pH值)和濃度對蛹蟲草產(chǎn)生單質(zhì)硒的影響。蛹蟲草菌絲在富硒培養(yǎng)的過程中,類似某些微生物會出現(xiàn)―紅硒現(xiàn)象‖,會有納米級單質(zhì)硒出現(xiàn),本研究利用該原理進行電鏡觀察。同一pH=5條件下,設置不同亞硒酸鹽濃度梯度,硒濃度范圍為20 mg/L～200 mg/L,實驗發(fā)現(xiàn)單質(zhì)硒主要在胞內(nèi)產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)蛹蟲草對亞硒酸鹽的吸收和同化的存在飽和現(xiàn)象。而在同一亞硒酸鹽濃度條件(25 mg/L)不同pH值條件下(pH=3,5,8),經(jīng)富硒培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲,不同pH值處理的菌絲單質(zhì)硒顆粒數(shù)量存在顯著差異,在一定程度上也說明了不同pH值條件下的不同形態(tài)的亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)運效率或途徑存在差異,其中pH=3時轉(zhuǎn)運效率和胞內(nèi)硒含量最低。3、蛹蟲硒轉(zhuǎn)運途徑動力學特征。pH=3條件下,蛹蟲草吸收亞硒酸鹽在的線性方程是y=0.002917x+0.02509,決定系數(shù)R~2=0.9492;pH=5條件下,蛹蟲草的亞硒酸鹽吸收量-濃度擬合曲線是非線性的,Km=76.92mg L~(-1) h-1mg~(-1),Vm=0.8986決定系數(shù)R~2=0.8986。pH=8條件下的蛹蟲草的線性方程是y=0.007752x+0.02506,決定系數(shù)R~2=0.8454而pH=8的米氏方程擬合,其決定系數(shù)R~2為0.8422,結(jié)果表明H_2SeO_3運輸以被動運輸為主,HSeO_3~-運輸以主動運輸為主,而SeO_3~(2-)運輸則可能為主動運輸和被動運輸同時作用。通過亞硒酸鹽動力學實驗結(jié)果和電鏡觀察結(jié)果,確定蛹蟲草存在多種對不同形態(tài)的亞硒酸鹽(SeO_3~(2-),HSeO_3~-,H_2SeO_3)存在親和性差異的轉(zhuǎn)運途徑。4、利用抑制劑探究蛹蟲草中硒轉(zhuǎn)運蛋白。利用水通道蛋白抑制劑和陰離子通道蛋白的抑制劑在不同pH條件下,對蛹蟲草吸收不同形態(tài)的亞硒酸鹽進行抑制,結(jié)果證明水通道蛋白是蛹蟲草中參與亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運的重要轉(zhuǎn)運體,并發(fā)現(xiàn)SeO_3~(2-),HSeO_3~-主要通過體積敏感的陰離子通道進入蛹蟲草菌絲。利用磷酸鹽和硫酸鹽在不同pH條件下,對蛹蟲草吸收不同形態(tài)的亞硒酸鹽進行競爭抑制實驗。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在pH=3時,高磷和低磷條件處理,低磷處理后抑制率達到40%,高磷處理后抑制率達到51%,pH=8時,高磷處理后蛹蟲草吸收亞硒酸鹽的含量不存在顯著性差異,低磷處理后抑制率可達14%;pH=8時低硫處理后抑制率可達到42%,高硫處理后抑制率可達19.5%。pH=5時低硫和低磷共處理后抑制率可達到27%,而單一添加磷酸鹽或硫酸鹽在pH=5條件下無抑制現(xiàn)象。結(jié)果可以確定蛹蟲草吸收鹽硒酸鹽的轉(zhuǎn)運共用磷酸鹽轉(zhuǎn)運途徑和硫酸鹽轉(zhuǎn)運途徑,轉(zhuǎn)運效率與亞硒酸鹽的形態(tài)有關。5、蛹蟲草中硒轉(zhuǎn)運蛋白的生物學信息和探究其調(diào)控機制。應用生物信息學方法,根據(jù)文獻選用Os NIP2:1(硫酸轉(zhuǎn)運子)、pho84、pho89(磷酸轉(zhuǎn)運子)、SUL2(硫酸轉(zhuǎn)運子)和蛹蟲草蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行蛋白序列比對,選出蛹蟲草中的硫酸轉(zhuǎn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)運蛋白、硫酸轉(zhuǎn)運蛋白,并結(jié)合作物栽培學實驗結(jié)果設計實驗條件,通過RT-PCR技術檢測目的基因的表達量,篩選出可靠的硒轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因如下:Os NIP2:1-analogue的CCM_00972,Pho84-analogue的CCM_09308,Su L2-analogue的CCM_00881。最后再通過設計不同的培育條件對硒轉(zhuǎn)運蛋白m RNA水平的調(diào)控實驗,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中水通道蛋白的基因受亞硒酸鹽形態(tài)和濃度的調(diào)控,而磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因則受pH值、亞硒酸鹽形態(tài)和濃度的調(diào)控,硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白則可能具有與釀酒酵母中SUL2相同的(硫酸鹽)使用依賴失活機制。
【學位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S567.3
【部分圖文】：

H+濃度和亞硒酸鹽形態(tài)以 H2SeO3為主的情況下，蛹蟲草對亞硒酸鹽（H2SeO3）的吸效率較低。由圖 1(c)可知，培養(yǎng)液中亞硒酸鹽濃度為 60 mg/L，不同 pH 處理的蟲草菌絲體的位質(zhì)量含硒量不存在顯著差異（p>0.05），此時 pH 值對蛹蟲草單位質(zhì)量的硒含量并無響。由圖 1(d)可知，培養(yǎng)液中亞硒酸鹽濃度為 60 mg/L 條件下，pH=5 條件處理菌絲硒效率遠高于 pH=3 條件處理，兩者之間存在顯著差異（p<0.05）；而 pH=8 條件處理pH=5 處理沒有顯著差異（p>0.05）。pH=3 處理的硒吸收效率較低。再次說明在溶液較高的 H+濃度和亞硒酸鹽形態(tài)以 H2SeO3為主的情況下，蛹蟲草對亞硒酸鹽（H2SeO的吸收效率較低。

由圖 2（d）可知，在富硒培養(yǎng)過程中，蛹蟲草的富硒效率，隨培養(yǎng)液中亞硒酸鹽的濃度的增加逐漸降低。其中培養(yǎng)液中亞硒酸鹽濃度為 15mg/L 和 30mg/L 條件下，蛹蟲草富硒效率較高，兩者之間不存在顯著差異（p>0.05）平均約 87.279%，而與其它較高的亞硒酸鹽濃度條件下的富硒率相比都存在顯著差異（p<0.05）。

、亞硒酸鹽濃度對蛹蟲草單質(zhì)硒析出的影響質(zhì)硒主要在蛹蟲草菌絲體的胞內(nèi)出現(xiàn)，是由亞硒酸鹽轉(zhuǎn)該現(xiàn)象在亞硒酸鹽培育富硒蛹蟲草的過程中出現(xiàn)，是蛹到飽和后而出現(xiàn)的一種保護機制。
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本文編號：2846404