大豆(Glycine max(L.)Meer.)是世界上重要的糧油兼用作物,其蛋白質(zhì)含量高、成本低,是人類和家畜優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)來源,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而,與其它來源于植物中的蛋白相似,大豆蛋白中的必需氨基酸蛋氨酸含量較低,無法滿足人類和家畜的營(yíng)養(yǎng)需求,限制了它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此,提高大豆蛋白中蛋氨酸的含量,對(duì)于提高大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì),改善人類膳食營(yíng)養(yǎng)以及促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展具有重要的實(shí)用價(jià)值。本研究一方面利用過表達(dá)蛋氨酸合成關(guān)鍵酶基因AtDCGS的轉(zhuǎn)基因大豆材料,與過表達(dá)富含蛋氨酸的玉米β-Zein儲(chǔ)藏蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)基因大豆材料進(jìn)行雜交,將兩個(gè)基因進(jìn)行聚合。另一方面,構(gòu)建同時(shí)攜帶AtDCGS和β-Zein基因的雙價(jià)表達(dá)載體,進(jìn)行大豆全株轉(zhuǎn)化,從而獲得共表達(dá)這兩個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)基因大豆材料。對(duì)雙價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆材料進(jìn)行了除草劑抗性篩選、PCR檢測(cè)、目的基因表達(dá)量檢測(cè)及Southern blot檢測(cè),并在溫室和田間種植進(jìn)行加代和篩選。目前,通過雜交獲得了10個(gè)F_3代雙價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆株系,通過轉(zhuǎn)化雙價(jià)表達(dá)載體獲得了45個(gè)T_3代雙價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆株系,篩選到了CZ-6和CZ-9兩個(gè)目的基因表達(dá)量高、外源基因拷貝數(shù)低且無表型異常的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)部分T_2代雙價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆株系和F_2代雙價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆株系及其親本的種子進(jìn)行了蛋氨酸含量的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型相比,轉(zhuǎn)AtDCGS基因的大豆籽粒中游離蛋氨酸含量最大提高到3.3倍,且種子特異型表達(dá)比組成型表達(dá)提高幅度更大。在共表達(dá)兩種外源基因的轉(zhuǎn)基因材料中,游離蛋氨酸含量比只轉(zhuǎn)AtDCGS基因的親本降低,同時(shí)總蛋氨酸含量比只轉(zhuǎn)β-Zein基因的親本進(jìn)一步提高,推測(cè)部分降低的游離蛋氨酸用于了儲(chǔ)藏蛋白的合成。與野生型相比,雙價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆籽�？偟鞍彼岷孔畲筇岣吡�22%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過結(jié)合蛋氨酸合成和儲(chǔ)藏兩條途徑,可以進(jìn)一步增加大豆籽粒內(nèi)蛋氨酸的積累。檢測(cè)了野生型和部分轉(zhuǎn)基因大豆種子總蛋白和脂肪含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋氨酸含量的提高伴隨著大豆籽粒蛋白的顯著增加,同時(shí)脂肪含量降低,推測(cè)游離蛋氨酸含量的不足是限制大豆蛋白積累的重要因素。因此,提高大豆籽粒內(nèi)蛋氨酸含量,對(duì)于改善大豆蛋白的品質(zhì)和含量都具有積極的影響。本研究通過基因工程的手段,從大豆蛋氨酸合成和儲(chǔ)藏兩方面進(jìn)行調(diào)控,提高了大豆籽粒儲(chǔ)藏蛋白中蛋氨酸的含量,改善了大豆蛋白的品質(zhì),同時(shí)也為其它作物的品質(zhì)改良提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

圖 1.1 天冬氨酸家族氨基酸代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Amir et al., 2012）Figure 1.1 The metabolic networks regulating the aspartate family amino acids（Amir et al., 2012）天冬氨酸激酶（Asp kinase,AK），二氫吡啶二羧酸合酶（dihydrodipicolinate synthase, DHPS），高絲氨酸脫氫酶homoserine dehydrogenase, HSD），同型絲氨酸激酶（homoserine kinase, HK），蘇氨酸激酶（Thr synthase, TS）蘇氨酸脫氫酶（Thr dehydratase, TDH），胱硫醚-γ-合成酶（cystathionine γ-synthase, CGS），胱硫醚-β-裂解酶cystathionine β-lyase, CBL），蛋氨酸合成酶（Met synthase, MS），S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM synthase, SAMS）S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM），甲基四氫葉酸（methyltetrahydrofolate, MTHF）.1.2 CGS 的表達(dá)調(diào)控CGS 被認(rèn)為是蛋氨酸合成途徑中的一個(gè)限速酶，它將來自天冬氨酸的碳骨架和來自半胱氨酸硫通過 γ 置換反應(yīng)生成了胱硫醚，隨后胱硫醚在其它酶的作用下生成了蛋氨酸，該反應(yīng)遵循乒反應(yīng)機(jī)制（Ravanel et al., 1998; Galili et al., 2005）。在擬南芥中，CGS 的 N 端區(qū)域具有重要的調(diào)節(jié)功能，該區(qū)域包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列和轉(zhuǎn)錄反饋調(diào)節(jié)的順式作用元件（Hagiwara-Komoda et al., 2014）。CGS 基因的表達(dá)水平受到蛋氨酸的游產(chǎn)物 SAM 的負(fù)調(diào)控，這種反饋調(diào)控的靶序列位于該基因的 N 端。雖然 N 端區(qū)域?qū)?CGS 基的表達(dá)調(diào)控具有重要作用，但是該區(qū)域缺失并不影響 CGS 的催化活性（Hacham et al., 200

圖 2.1 溫室 F1代雜交材料除草劑篩選(A) 噴施草甘膦和草丁膦的野生型植株，(B) 噴施草甘膦和草丁膦的雜交植株Figure 2.1 The herbicide screening of the first filial generation in green houseA) Wild-type meterials treated with glyphosate and glufosinate, (B) Crossing plant treated with glyphosate andglufosinateF2代材料種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北圃場(chǎng)網(wǎng)室中，大田種植，以野生型材料作為陰性對(duì)照施草甘膦和草丁膦除草劑。5 日后野生型材料及陰性材料葉片枯黃，陽性材料生長(zhǎng)未見。

圖 2.1 溫室 F1代雜交材料除草劑篩選(A) 噴施草甘膦和草丁膦的野生型植株，(B) 噴施草甘膦和草丁膦的雜交植株Figure 2.1 The herbicide screening of the first filial generation in green house-type meterials treated with glyphosate and glufosinate, (B) Crossing plant treated with glypglufosinate料種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北圃場(chǎng)網(wǎng)室中，大田種植，以野生型材料作為陰膦和草丁膦除草劑。5 日后野生型材料及陰性材料葉片枯黃，陽性材料生
【參考文獻(xiàn)】

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1 YU Yang;HOU Wen-sheng;Yael Hacham;SUN Shi;WU Cun-xiang;Ifat Matityahu;SONG Shi-kui;Rachel Amir;HAN Tian-fu;;Constitutive expression of feedback-insensitive cystathionine γ-synthase increases methionine levels in soybean leaves and seeds[J];Journal of Integrative Agriculture;2018年01期

2 韓慶梅;孫石;侯文勝;吳存祥;白肖飛;于洋;周艷峰;韓天富;;高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因大豆的鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析[J];中國(guó)油料作物學(xué)報(bào);2015年06期

本文編號(hào)：2840401