【目的】研究中緬邊境間日瘧原蟲對氯喹等7種抗瘧藥物的體外敏感性及其相關基因的多態(tài)性。【方法】1.將分離自中緬邊境經(jīng)鏡檢與PCR確認的間日瘧患者的血樣進行短期體外培養(yǎng),采用微量法檢測間日瘧原蟲對氯喹、磷酸咯萘啶、磷酸哌喹、雙氫青蒿素、奎寧、青蒿琥酯和甲氟奎的藥物敏感性,以藥物IC50值(nM)來表示。2.提取間日瘧原蟲的DNA,應用PCR技術對其分別擴增Pvmdrl,Pvcrt-o,Pvdhfr和Pvdhps四種基因。測序之后,與標準株Salvador I進行序列比對,得到其基因突變情況；應用Real-Time PCR方法對Pvmdrl基因進行拷貝數(shù)擴增,與Pvaldolese基因比較,得到其拷貝數(shù)情況。3.體外藥物敏感性測定結果與基因突變結果結合分析,研究二者是否有相關性；分析Pvmdrl拷貝數(shù)是否與藥物敏感性相關�！窘Y果】1.體外藥物敏感性測定結果：對58株中緬邊境間日瘧原蟲進行體外培養(yǎng),成功培養(yǎng)至裂殖體階段共26株,其氯喹、青蒿琥酯、雙氫青蒿素、甲氟奎、磷酸咯萘啶、磷酸哌喹、奎寧的IC50值(nM)的幾何均數(shù)((Geometric mean)分別為65.52、9.65、7.42、33.15、76.73、34.13、41.57；幾何均數(shù)的95%置信區(qū)間(95%CIof geo.Mean)分別為41.76～102.8、6.07～15.34、4.68～11.8、23.46～46.85、47.63～123.6、19.66～59.28、28.53～60.59;中位數(shù)(Median)分別為81.37、9.78、7.52、35.88、45.85、28.51、60.90。其中,氯喹不敏感株有3株,比例為11.54%。2.基因多態(tài)性研究結果：2.1 Pvmdrl基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進行擴增,得到Pvmdrl基因全序列4606bp。本研究中S513R、T529、G698S、M908L、T958M、K997R、F1076L、S1358、K1393N共9個位點均發(fā)現(xiàn)突變,突變率分別為11.45%、89.16%、98.8%、100%、100%、0.6%、76.51%、17.47%、19.28%,而Y976F、L1022、F1233、E1396位點均未發(fā)現(xiàn)突變。與氯喹敏感性相關的Y976F、F1076L位點突變率分別為0、76.51%,兩個突變位點均是野生株的數(shù)目為39株(23.49%)。2.2 Pvcrt-o基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進行擴增,得到Pvcrt-o基因1702bp片段,本研究中所有樣本均在P297位點發(fā)生了同義突變,未發(fā)現(xiàn)其他突變位點。2.3Pvdhps基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進行擴增,得到Pvdhps基因767 bp片段。本研究中S382A/C、A383G、 K512M、 A553G共4個位點均發(fā)生了突變,其中A383G、A553G位點突變較常見,突變率分別為64.45%、33.12%。常見的單倍型為SGKAV (37.35%)和SGKGV(23.49%),以及野生株SAKAV(29.52%)。四突變AGMGV、雙突變SAMGV和單突變SAKGV的突變率分別為3.61%、0.60%、5.42%。2.4 Pvdhfr基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進行擴增,得到Pvdhfr基因632 bp片段。本研究中F57L/I、S58R、T61M、S117N/T4個位點均發(fā)生了突變,其中S58R、T61M、S117N/T位點突變最常見,突變率分別為50%、38.55%、36.75%。常見的單倍型為野生株IPFSTSI (50%)和IPLRMTI (34.94%)。雙突變IPFRTT、IPFRTNI和三突變IPLRMSI的突變率分別為1.81%、9.64%、3.61%。2.5 Pvmdrl基因拷貝數(shù)：將26株體外培養(yǎng)成功的間日瘧原蟲DNA進行Pvmdrl基因拷貝數(shù)擴增,結果顯示26株均為單拷貝。3.體外測定結果與分子測定結果的相關性：氯喹IC50值、氯喹敏感株與不敏感株數(shù)分別與Pvmdrl基因突變結果的相關性分析,結果顯示均無相關性(P0.05)�！窘Y論】1.中緬邊境間日瘧原蟲存在氯喹敏感性降低的現(xiàn)象。2.中緬邊境氯喹ICso值與Pvmdrl基因突變結果之間無相關性；氯喹敏感株與不敏感株數(shù)與Pvmdrl基因突變結果之間無相關性。3.中緬邊境間日瘧原蟲Pvmdrl基因未出現(xiàn)拷貝數(shù)增加現(xiàn)象。4.中緬邊境Pvcrt-o基因除P297位點發(fā)現(xiàn)同義突變以外,未發(fā)現(xiàn)有其他突變位點。5.中緬邊境Pvdhps和Pvdhfr基因單倍型與中國中部結果比較,差異有顯著性。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R531.3
【部分圖文】：

??＿圖１?２０１０年世界間日拒疾的空間分布??氯唾（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ／ＣＱ）自１９４６年Ｗ來一直被用做間日炬疾流行地區(qū)的一線??治療藥物，也用來預防間日炬疾在拒疾低風險地區(qū)的傳播。然而，在炬疾流行國??家，治療間日拒時對氯哇大規(guī)模的持續(xù)長期使用引發(fā)了氯睡抗藥性的出現(xiàn)，導致??

■乂－－．一＇―、??Ｉ．??圖２中銅邊境中國柜疾感染區(qū)域??目前檢測藥物敏感性手段主要分為體內檢測、體外檢測、動物模型體內檢分子標志物檢測。體外藥物敏感性檢測技術及分子標志物檢測是目前拒原蟲敏性檢測最常用的手段。體外藥物敏感性的檢測原來主要應用于惡性拒原蟲，間

圖３中銅邊境間日炬原蟲采樣地??２實驗儀器、試劑來源及配制??２．１主要實驗儀器??
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本文編號：2840390