發(fā)布時(shí)間：2020-10-14 07:45

　　 【目的】研究中緬邊境間日瘧原蟲對(duì)氯喹等7種抗瘧藥物的體外敏感性及其相關(guān)基因的多態(tài)性。【方法】1.將分離自中緬邊境經(jīng)鏡檢與PCR確認(rèn)的間日瘧患者的血樣進(jìn)行短期體外培養(yǎng),采用微量法檢測(cè)間日瘧原蟲對(duì)氯喹、磷酸咯萘啶、磷酸哌喹、雙氫青蒿素、奎寧、青蒿琥酯和甲氟奎的藥物敏感性,以藥物IC50值(nM)來表示。2.提取間日瘧原蟲的DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)其分別擴(kuò)增Pvmdrl,Pvcrt-o,Pvdhfr和Pvdhps四種基因。測(cè)序之后,與標(biāo)準(zhǔn)株Salvador I進(jìn)行序列比對(duì),得到其基因突變情況；應(yīng)用Real-Time PCR方法對(duì)Pvmdrl基因進(jìn)行拷貝數(shù)擴(kuò)增,與Pvaldolese基因比較,得到其拷貝數(shù)情況。3.體外藥物敏感性測(cè)定結(jié)果與基因突變結(jié)果結(jié)合分析,研究二者是否有相關(guān)性；分析Pvmdrl拷貝數(shù)是否與藥物敏感性相關(guān)�！窘Y(jié)果】1.體外藥物敏感性測(cè)定結(jié)果：對(duì)58株中緬邊境間日瘧原蟲進(jìn)行體外培養(yǎng),成功培養(yǎng)至裂殖體階段共26株,其氯喹、青蒿琥酯、雙氫青蒿素、甲氟奎、磷酸咯萘啶、磷酸哌喹、奎寧的IC50值(nM)的幾何均數(shù)((Geometric mean)分別為65.52、9.65、7.42、33.15、76.73、34.13、41.57；幾何均數(shù)的95%置信區(qū)間(95%CIof geo.Mean)分別為41.76～102.8、6.07～15.34、4.68～11.8、23.46～46.85、47.63～123.6、19.66～59.28、28.53～60.59;中位數(shù)(Median)分別為81.37、9.78、7.52、35.88、45.85、28.51、60.90。其中,氯喹不敏感株有3株,比例為11.54%。2.基因多態(tài)性研究結(jié)果：2.1 Pvmdrl基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到Pvmdrl基因全序列4606bp。本研究中S513R、T529、G698S、M908L、T958M、K997R、F1076L、S1358、K1393N共9個(gè)位點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)突變,突變率分別為11.45%、89.16%、98.8%、100%、100%、0.6%、76.51%、17.47%、19.28%,而Y976F、L1022、F1233、E1396位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)突變。與氯喹敏感性相關(guān)的Y976F、F1076L位點(diǎn)突變率分別為0、76.51%,兩個(gè)突變位點(diǎn)均是野生株的數(shù)目為39株(23.49%)。2.2 Pvcrt-o基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到Pvcrt-o基因1702bp片段,本研究中所有樣本均在P297位點(diǎn)發(fā)生了同義突變,未發(fā)現(xiàn)其他突變位點(diǎn)。2.3Pvdhps基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到Pvdhps基因767 bp片段。本研究中S382A/C、A383G、 K512M、 A553G共4個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了突變,其中A383G、A553G位點(diǎn)突變較常見,突變率分別為64.45%、33.12%。常見的單倍型為SGKAV (37.35%)和SGKGV(23.49%),以及野生株SAKAV(29.52%)。四突變AGMGV、雙突變SAMGV和單突變SAKGV的突變率分別為3.61%、0.60%、5.42%。2.4 Pvdhfr基因：將中緬邊境間日瘧原蟲培養(yǎng)與未培養(yǎng)蟲株共166株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到Pvdhfr基因632 bp片段。本研究中F57L/I、S58R、T61M、S117N/T4個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了突變,其中S58R、T61M、S117N/T位點(diǎn)突變最常見,突變率分別為50%、38.55%、36.75%。常見的單倍型為野生株IPFSTSI (50%)和IPLRMTI (34.94%)。雙突變IPFRTT、IPFRTNI和三突變IPLRMSI的突變率分別為1.81%、9.64%、3.61%。2.5 Pvmdrl基因拷貝數(shù)：將26株體外培養(yǎng)成功的間日瘧原蟲DNA進(jìn)行Pvmdrl基因拷貝數(shù)擴(kuò)增,結(jié)果顯示26株均為單拷貝。3.體外測(cè)定結(jié)果與分子測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性：氯喹IC50值、氯喹敏感株與不敏感株數(shù)分別與Pvmdrl基因突變結(jié)果的相關(guān)性分析,結(jié)果顯示均無(wú)相關(guān)性(P0.05)�！窘Y(jié)論】1.中緬邊境間日瘧原蟲存在氯喹敏感性降低的現(xiàn)象。2.中緬邊境氯喹ICso值與Pvmdrl基因突變結(jié)果之間無(wú)相關(guān)性；氯喹敏感株與不敏感株數(shù)與Pvmdrl基因突變結(jié)果之間無(wú)相關(guān)性。3.中緬邊境間日瘧原蟲Pvmdrl基因未出現(xiàn)拷貝數(shù)增加現(xiàn)象。4.中緬邊境Pvcrt-o基因除P297位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)同義突變以外,未發(fā)現(xiàn)有其他突變位點(diǎn)。5.中緬邊境Pvdhps和Pvdhfr基因單倍型與中國(guó)中部結(jié)果比較,差異有顯著性。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R531.3
【部分圖文】：

??＿圖１?２０１０年世界間日拒疾的空間分布??氯唾（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ／ＣＱ）自１９４６年Ｗ來一直被用做間日炬疾流行地區(qū)的一線??治療藥物，也用來預(yù)防間日炬疾在拒疾低風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的傳播。然而，在炬疾流行國(guó)??家，治療間日拒時(shí)對(duì)氯哇大規(guī)模的持續(xù)長(zhǎng)期使用引發(fā)了氯睡抗藥性的出現(xiàn)，導(dǎo)致??

■乂－－．一＇―、??Ｉ．??圖２中銅邊境中國(guó)柜疾感染區(qū)域??目前檢測(cè)藥物敏感性手段主要分為體內(nèi)檢測(cè)、體外檢測(cè)、動(dòng)物模型體內(nèi)檢分子標(biāo)志物檢測(cè)。體外藥物敏感性檢測(cè)技術(shù)及分子標(biāo)志物檢測(cè)是目前拒原蟲敏性檢測(cè)最常用的手段。體外藥物敏感性的檢測(cè)原來主要應(yīng)用于惡性拒原蟲，間

圖３中銅邊境間日炬原蟲采樣地??２實(shí)驗(yàn)儀器、試劑來源及配制??２．１主要實(shí)驗(yàn)儀器??
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本文編號(hào)：2840390