在楊樹(shù)中,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析,反映出某些基因?qū)顦?shù)側(cè)根的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用,我們通過(guò)建立一個(gè)遺傳網(wǎng)絡(luò)包含了大比例的差異調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,其中只有三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)根系發(fā)育有強(qiáng)烈的影響,在低氮條件下,上下調(diào)節(jié)這三個(gè)基因分別引起根的增加和減少,轉(zhuǎn)錄因子PtrNAC1就是其中之一。本實(shí)驗(yàn)先對(duì)PtrNAC1基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)毛果楊NAC蛋白在氨基酸序列12-137位有一個(gè)結(jié)構(gòu)域,并且該結(jié)構(gòu)域保守。我們從毛果楊根部的全基因組中克隆了PtrNAC 基因,并構(gòu)建了植物表達(dá)載體pROKII-PtrNAC1,分別進(jìn)行煙草和84K楊的遺傳轉(zhuǎn)化并分別獲得了抗性植株,以此為材料,我們進(jìn)行低氮處理,分別設(shè)置了0、5mMNH4Cl、10mM NH4Cl、5mMNaNO3、10mMNaNO3 處理液,對(duì)處理后的非轉(zhuǎn)基因株系與轉(zhuǎn)基因株系分別進(jìn)行葉綠素含量、氮含量及生理生化指標(biāo)的測(cè)定,得出結(jié)論:(1)PtrAC1基因全長(zhǎng)918bp,蛋白氨基酸殘基數(shù)為305,相對(duì)分子質(zhì)量34655.33,等電點(diǎn)PI為6.71,呈酸性,為不穩(wěn)定蛋白,疏水性蛋白,通過(guò)分析預(yù)測(cè)其存在一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域NAC。(2)構(gòu)建pROKⅡ-PtrNAC1植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化并獲得抗性植株,選取基因表達(dá)量高、中、低三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)其進(jìn)行低氮處理,并對(duì)其葉片進(jìn)行生理生化指標(biāo)(POD、SOD、MDA)的測(cè)定。結(jié)果表明:在低氮處理下,轉(zhuǎn)基因煙草優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因煙草,其中高表達(dá)量的L1差異顯著。(3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行84K楊遺傳轉(zhuǎn)化并獲得抗性植株,選取基因表達(dá)量高、中、低三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行低氮處理,并對(duì)其葉片進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定,對(duì)其葉片與根進(jìn)行硝態(tài)氮、銨態(tài)氮與生理生化指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明:在低氮處理下,轉(zhuǎn)基因84K楊的葉綠素含量、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量均高于非轉(zhuǎn)基因84K楊,生理生化測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因84K楊優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因84K楊,其中高表達(dá)量的L1差異顯著。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S792.11
【部分圖文】：

圖２－１毛果楊ＲＮＡ提取及毛果楊Ｐ／ｒＡＭＣ７基因克隆的結(jié)果逡逑毛果楊總邋ＲＮＡ邋提取．Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１－２：毛果楊總邋ＲＮＡ；逡逑毛果楊Ｐ／／ＷＪＣ／基因克�。停哄澹模危粒恚幔颍耄澹颍模蹋担埃埃埃诲澹保好麠睿校祝剩茫罚校茫耶a(chǎn)物；逡逑ＡＳＹ－ＴＨ／ｒＡ＾ａ菌液ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果逡逑，ｉｓｓ逡逑圖邋２－２邋ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ｉＶ＿Ｍ４Ｃ７邋菌液邋ＰＣＲ邋檢測(cè)結(jié)果逡逑ＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ５０００；邋１－８：邋ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ＰｔｒＮＡＣｌ邋菌液邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物；逡逑一

２．４．５毛果楊進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建逡逑利用ＭＥＧＡ７．０軟件對(duì)毛果楊基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，使用逡逑鄰接法Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ邋（ＮＪ）預(yù)測(cè)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，見(jiàn)圖２－５，結(jié)果顯示，毛果楊ＰｔｒＮＡＣｌ與逡逑胡楊（７＾界／ｚｗｗｐ／ｚｒａ／ｔｏ／）的ＮＡＣ－２１／２２－ｌｉｋｅ在進(jìn)化關(guān)系上更近一錢(qián)。逡逑５１］邐Ｒｉｃｉｎｕｓ邋ｃｏｍｍｕｎｉｓ逡逑９９邐邐Ｊａｔｒｏｐｈａ邋ｃｕｒｃａｓ逡逑２0邐邐Ｈｅｖｅａ邋ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ逡逑——Ｐｏｐｏｌｕｓ邋ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ逡逑４３邐ｉ00逡逑邐邐邐Ｐｏｐｕｌｕｓ邋ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ逡逑邐Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ邋ｃａｃａｏ逡逑４０邐Ｊｕｇｌａｎｓ邋ｒｅｇｉａ逡逑邐Ｇｌｙｃｉｎｅ邋ｍａｘ逡逑１００邐Ｃａｊａｎｕｓ邋ｃａｊａｎ逡逑邐Ｃａｍｅｌｌｉａ邋ｓｉｎｅｎｓｉｓ逡逑Ｉ邐１逡逑０．０５０逡逑圖２－５毛果楊ＰｔｒＮＡＣｌ蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析逡逑從上至下分別為：蓖麻、麻風(fēng)樹(shù)、橡膠樹(shù)、毛果楊、胡楊、可可樹(shù)、胡桃、大豆、木豆、茶逡逑樹(shù)逡逑２．５本章小結(jié)逡逑本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)毛果楊根部總ＲＮＡ提取，反轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ為模板，用表２－２中的特異性逡逑弓丨物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，獲得毛果楊基因片段。逡逑毛果楊基因全長(zhǎng)９１８ｂｐ，蛋白氨基酸殘基數(shù)為３０５，相對(duì)分子質(zhì)量３４６５５．３３，逡逑等電點(diǎn)ＰＩ為６．７１，呈酸性，為不穩(wěn)定蛋白，疏水性蛋白。通過(guò)分析工具Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎ逡逑Ｓｅａｒｃｈ邋Ｓｅｒｖｉｃｅ邋（ＣＤＳｅａｒｃｈ）預(yù)測(cè)毛果楊蛋白的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在１２－１３７位處

的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１中，隨機(jī)挑取培養(yǎng)基上的單克隆，進(jìn)行質(zhì)粒ＰＣＲ驗(yàn)逡逑證。ＰＣＲ結(jié)果顯示，ＰＣＲ產(chǎn)物條帶大小與目的條帶大小一致，因此確定ｐＲＯＫｌＩ－逡逑重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１中（圖３－１）。逡逑圖邋３－１邋ｐＲＯＫＨ－ＰａＡ＾Ｃｉ邋菌液邋ＰＣＲ邋結(jié)果逡逑Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１－８：邋ｐＲＯＫｌＩ－尸菌液邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物；逡逑３．３．２毛果楊轉(zhuǎn)基因煙草抗性植株的獲得及鑒定逡逑３．３．２．１毛果楊轉(zhuǎn)基因煙草抗性植株獲得逡逑通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)在含有４５ｍｇ／Ｌ邋Ｋａｎ的ＭＳ分化培養(yǎng)逡逑基中（圖３－２－Ａ），獲得抗性愈傷，培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)到含有５０ｍｇ／ＬＫａｎ的ＭＳ分化逡逑培養(yǎng)基中（圖３－２－Ｂ），獲得抗性芽，移至ＭＳ生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根（圖３－２－Ｃ）。逡逑圖３－２毛果楊ＡｒＡ＾ＩＣ／轉(zhuǎn)勵(lì)Ｎ煙草的獲得逡逑Ａ：毛果楊轉(zhuǎn)基因煙草抗性愈傷；Ｂ：毛果楊Ｐ／ｒＡ６４Ｃ／轉(zhuǎn)基因煙草抗性芽；逡逑Ｃ：毛果楊尸／ＭＭＣ？轉(zhuǎn)基因煙草抗性植株逡逑３．３．２．２毛果楊竹R嚕茫紛蜓灘菘剮災(zāi)倉(cāng)甑募ㄥ義希保睿校潁睿鄭剩茫蜓灘菘剮災(zāi)倉(cāng)甑募ㄥ義咸崛》親蜓灘鶯退兇蜓灘菀鍍埽模危�，并作为模板，７w遙希耍桑桑義希疲椅錚鐨蛄屑恚常擔(dān)校校茫壹觳�，ＰＣＲ体蠈�(dǎo)恚常�，邋ＰＣｍ�(yè)絳蚣恚常義希罰耘└司柿Ｗ魑糶遠(yuǎn)哉�，酚H蠔退魑跣遠(yuǎn)哉�，ＰＣａt(yī)峁允荊鑠義希玻埃義

本文編號(hào)：2832890