開花是種子植物生活史中最重要的事件之一。以往的研究表明,植物成花調(diào)控的關(guān)鍵基因相對(duì)保守,過量表達(dá)一年生草本或多年生木本來源的開花素基因Flowering Locus T(FT)及與之互作的b ZIP家族轉(zhuǎn)錄因子基因Flowering Locus D(FD)等成花促進(jìn)基因均能夠使轉(zhuǎn)基因植株提早開花。作為研究多年生木本植物,蘋果中的Md FT1/2基因的早花功能早在2010年就已被鑒定,但對(duì)于Md FD基因至今尚無報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析、轉(zhuǎn)基因植物表型鑒定、酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)等方法對(duì)蘋果Md FD基因的功能及其與Md FT1的相互作用進(jìn)行了初步研究,并以山定子與早花山定子為試材,對(duì)重要的開花調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子差異進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下:1.利用DNAMAN、MAGE等在線分析軟件對(duì)Md FD基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)Md FD與枇杷中FD同源基因親緣關(guān)系最近,開放閱讀框?yàn)?40 bp,包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,編碼279個(gè)氨基酸殘基,其蛋白的分子量為30.207 k Da,等電點(diǎn)10.01,為親水性蛋白質(zhì)。利用在線分析軟件Plant CARE對(duì)Md FD基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該基因啟動(dòng)子序列中含有光響應(yīng)元件、晝夜節(jié)律調(diào)控元件、ABA、生長(zhǎng)素及Me JA等植物激素響應(yīng)元件。2.利用熒光定量PCR對(duì)Md FD基因的季節(jié)性表達(dá)特征進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MdFD基因存在兩個(gè)表達(dá)高峰,分別出現(xiàn)在九月和次年一月份,在四月份和五月份表達(dá)量低。3.構(gòu)建了MdFD基因過表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化野生型擬南芥和fd突變體,對(duì)MdFD基因的功能進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示與對(duì)照植株相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠早花。構(gòu)建酵母雙雜交表達(dá)載體及雙分子熒光互補(bǔ)表達(dá)載體,對(duì)Md FD與Md FT1的相互作用進(jìn)行分析。酵母雙雜交分析顯示,Md FD蛋白具有自主激活活性,自身能形成同源二聚體,Md FD與MdFT1蛋白互作;雙分子熒光互補(bǔ)顯示,在植物體內(nèi)MdFD與MdFT1蛋白互作。4.對(duì)不同開花相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)特征分析顯示,早花山定子中Mb FD、Mb FT1、Mb AP1等多個(gè)重要開花相關(guān)基因的表達(dá)均高于山定子;對(duì)兩份資源啟動(dòng)子序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),山定子和早花山定子Mb AP1基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件存在差異。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S661.1
【部分圖文】：

2.1.10.2 MdFD 基因表達(dá)分析依據(jù) MdFD 序列，設(shè)計(jì)定量引物，以 AtQub 作為內(nèi)參基因，采用三步法進(jìn)行熒光定量 PCR分析，方法同上。2.2 結(jié)果與分析2.2.1 MdFD 基因克隆及生物信息學(xué)分析2.2.1.1 MdFD 基因結(jié)構(gòu)分析及克隆根據(jù)已知的擬南芥 AtFD 基因序列，通過在線分析軟件 NCBI 進(jìn)行 Blast，篩選得到蘋果 FD同源基因 MdFD 基因序列，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，以‘嘎啦’蘋果莖尖分生組織 cDNA 為模板擴(kuò)增 MdFD 基因。經(jīng) DNAMAN 分析結(jié)果顯示，MdFD 開放閱讀框?yàn)?840 bp，編碼 279 個(gè)氨基酸殘基，其蛋白的分子量為 30.207 kDa，等電點(diǎn) 10.01，為親水性蛋白質(zhì)。通過在蘋果基因組上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示 MdFD 定位到第 15 號(hào)染色體上，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蘋果 FD 同源基因 MdFD 與擬南芥 FD 基因結(jié)構(gòu)一樣，都含有 3 個(gè)外顯子和 2 個(gè)內(nèi)含子（圖 2-1）。

蘋果MdFD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

bZIP功能域保守性分析

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號(hào)：2832829