發(fā)布時(shí)間：2020-09-30 15:59

　　 輪狀病毒(Rotavirus,RV)是一種無(wú)包膜的二十面體形狀的雙鏈RNA病毒,是引起五歲以下嬰幼兒腹瀉的主要病原體。有關(guān)RV感染細(xì)胞后的復(fù)制機(jī)制尚不十分清楚。有研究表明,病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制與細(xì)胞代謝的某些環(huán)節(jié)相關(guān),其中細(xì)胞miRNAs表達(dá)水平是主要因素。miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的非編碼小RNA分子,其作用可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過(guò)程過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響細(xì)胞分裂過(guò)程。病毒也許正是通過(guò)改變細(xì)胞miRNAs的表達(dá),操控宿主細(xì)胞蛋白水平的表達(dá),達(dá)到促進(jìn)自身復(fù)制的目的。RV感染后是否引起細(xì)胞miRNAs表達(dá)的改變,miRNAs作用的靶點(diǎn)是什么,通過(guò)什么途徑進(jìn)行調(diào)控以影響RV的復(fù)制。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)RV感染細(xì)胞后,宿主細(xì)胞miR-125a-3p表達(dá)水平下調(diào),并且miR-125a-3p與RV的作用關(guān)系尚不明確,針對(duì)這一現(xiàn)象展開(kāi)了較深入的研究。本論文研究目的探討miR-125a-3p在RV感染細(xì)胞后下調(diào)的真實(shí)性,尋找該分子的作用靶點(diǎn),相互作用機(jī)制及在RV復(fù)制過(guò)程中的作用關(guān)系。研究方法:用RV毒株(ZTR-68)G1P[8]型(源于流行地區(qū)的致病毒株)感染MA104細(xì)胞(恒河猴腎細(xì)胞,對(duì)RV敏感)后,檢測(cè)宿細(xì)胞miRNAs的表達(dá)譜,深度測(cè)序確定表達(dá)差異的miRNA分子。用miRanda軟件進(jìn)行比較預(yù)測(cè)尋找miRNAs可能作用靶點(diǎn)。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA分子與其靶基因的關(guān)系,進(jìn)一步利用體外轉(zhuǎn)染該分子模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor)評(píng)價(jià)下游靶基因的表達(dá)。RT-qPCR、免疫熒光等方法檢測(cè)靶基因的表達(dá),以及通過(guò)上下調(diào)靶基因檢測(cè)RV的復(fù)制情況。用免疫共沉淀法探測(cè)了靶基因與RV相互作用關(guān)系的結(jié)合位點(diǎn)。研究結(jié)果:RV感染MA104細(xì)胞后,miRNAs有表達(dá)差異,深度測(cè)序表示:該差異分子為miR-125a-3p,且miR-125a-3p能夠抑制RV的復(fù)制;miRanda預(yù)測(cè)提示多聚嘧啶結(jié)合蛋白(PTB)是該分子的可能靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)二者存在靶定關(guān)系,經(jīng)過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)miR-125a-3p發(fā)現(xiàn),miR-125a-3p能下調(diào)PTB的表達(dá);PTB在感染早期定位于胞核,后期遷移出至胞質(zhì)。通過(guò)調(diào)節(jié)PTB的表達(dá)試驗(yàn)證實(shí),PTB能促進(jìn)RV復(fù)制。經(jīng)免疫共沉淀試驗(yàn)明確了 PTB作用于RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3,二者協(xié)同促進(jìn)病毒的復(fù)制。結(jié)論:miR-125a-3p是宿主細(xì)胞抗病毒復(fù)制的主要因素,對(duì)病毒復(fù)制起到抑制作用。RV感染細(xì)胞后,通過(guò)下調(diào)宿主細(xì)胞miR-125a-3p表達(dá),解除對(duì)靶基因PTB的抑制,影響宿主細(xì)胞蛋白翻譯以促進(jìn)病毒自身蛋白的翻譯,裝配形成完整的子代病毒。該研究結(jié)果有助于了解揭示RV感染細(xì)胞復(fù)制機(jī)理,也可為尋找抗RV藥物靶點(diǎn)提供線(xiàn)索。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：R373
【部分圖文】：

胞和乳腺癌細(xì)胞ＭＣＦ－７中呈現(xiàn)高表達(dá)情況，在疫苗生產(chǎn)用Ｖｅｒｏ細(xì)胞中ＰＴＢ表達(dá)水逡逑平也很高，但在ＫＭＢ１７細(xì)胞和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)水平很低，在大鼠的神逡逑經(jīng)干細(xì)胞中不表達(dá)ＰＴＢ邋（圖１）。逡逑７逡逑

相應(yīng)病毒蛋白的表達(dá)，說(shuō)明ＭＡ１０４細(xì)胞和ＫＭＢ１７細(xì)胞表面均具有ＲＶ感染的必須逡逑受體。但在病毒感染１６ｈ后，ＫＭＢ１７細(xì)胞中檢測(cè)到的輪狀病毒蛋白表達(dá)量與ＭＡ１０４逡逑細(xì)胞和Ｖｅｒｏ細(xì)胞中的病毒蛋白表達(dá)量有明顯差異（圖２）。將野毒株ＺＴＲ－６８感染逡逑ＭＡ１０４細(xì)胞和ＫＭＢ１７細(xì)胞后進(jìn)行連續(xù)傳代，ＺＴＲ－６８株無(wú)法適應(yīng)生長(zhǎng)于ＫＭＢ１７細(xì)逡逑胞。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果表明，ＰＴＢ在ＭＡ１０４細(xì)胞和Ｖｅｒｏ細(xì)胞中高表達(dá)，而在ＫＭＢ１７逡逑細(xì)胞中表達(dá)水平很低（圖３）。這一結(jié)果提示我們，ＰＴＢ可能與輪狀病毒在不同宿主逡逑細(xì)胞中的感染敏感性有很強(qiáng)的相關(guān)性，對(duì)輪狀病毒的復(fù)制和增殖起到促進(jìn)作用。逡逑ｓｓＨＩＩＢＨ逡逑ＥＨｈＢＨｈ邐＾逡逑■■逡逑圖２輪狀病毒ＺＴＲ－６８感染ＭＡ１０４邋（Ａ、Ｂ）和ＫＭＢ１７邋（Ｃ、Ｄ）細(xì)胞１６ｈ后檢測(cè)病毒蛋逡逑白逡逑Ｈｅｌａ邋ＭＡ１０４邐ＭＡ１０４邋ＫＭＢ１７邋ＫＭＢ１７逡逑Ｐ３５邐Ｐ４０邐Ｐ４０邐Ｐ５０逡逑圖３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＰＴＢ在ＭＡ１０４和ＫＭＢ邋１７細(xì)胞中的表達(dá)量逡逑通過(guò)免疫熒光檢測(cè)感染ＥＶ７１，ＣＡ１６，腺病毒及輪狀病毒后ＰＴＢ蛋白的表達(dá)及逡逑８逡逑

ＭＡ１０４細(xì)胞和ＫＭＢ１７細(xì)胞后進(jìn)行連續(xù)傳代，ＺＴＲ－６８株無(wú)法適應(yīng)生長(zhǎng)于ＫＭＢ１７細(xì)逡逑胞。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果表明，ＰＴＢ在ＭＡ１０４細(xì)胞和Ｖｅｒｏ細(xì)胞中高表達(dá)，而在ＫＭＢ１７逡逑細(xì)胞中表達(dá)水平很低（圖３）。這一結(jié)果提示我們，ＰＴＢ可能與輪狀病毒在不同宿主逡逑細(xì)胞中的感染敏感性有很強(qiáng)的相關(guān)性，對(duì)輪狀病毒的復(fù)制和增殖起到促進(jìn)作用。逡逑ｓｓＨＩＩＢＨ逡逑ＥＨｈＢＨｈ邐＾逡逑■■逡逑圖２輪狀病毒ＺＴＲ－６８感染ＭＡ１０４邋（Ａ、Ｂ）和ＫＭＢ１７邋（Ｃ、Ｄ）細(xì)胞１６ｈ后檢測(cè)病毒蛋逡逑白逡逑Ｈｅｌａ邋ＭＡ１０４邐ＭＡ１０４邋ＫＭＢ１７邋ＫＭＢ１７逡逑Ｐ３５邐Ｐ４０邐Ｐ４０邐Ｐ５０逡逑圖３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＰＴＢ在ＭＡ１０４和ＫＭＢ邋１７細(xì)胞中的表達(dá)量逡逑通過(guò)免疫熒光檢測(cè)感染ＥＶ７１，ＣＡ１６，腺病毒及輪狀病毒后ＰＴＢ蛋白的表達(dá)及逡逑８逡逑

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