輪狀病毒(Rotavirus,RV)是一種無包膜的二十面體形狀的雙鏈RNA病毒,是引起五歲以下嬰幼兒腹瀉的主要病原體。有關RV感染細胞后的復制機制尚不十分清楚。有研究表明,病毒在宿主細胞中的復制與細胞代謝的某些環(huán)節(jié)相關,其中細胞miRNAs表達水平是主要因素。miRNAs是一類長度約為22個堿基的非編碼小RNA分子,其作用可調節(jié)細胞代謝過程過程中的轉錄,進而影響細胞分裂過程。病毒也許正是通過改變細胞miRNAs的表達,操控宿主細胞蛋白水平的表達,達到促進自身復制的目的。RV感染后是否引起細胞miRNAs表達的改變,miRNAs作用的靶點是什么,通過什么途徑進行調控以影響RV的復制。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)RV感染細胞后,宿主細胞miR-125a-3p表達水平下調,并且miR-125a-3p與RV的作用關系尚不明確,針對這一現(xiàn)象展開了較深入的研究。本論文研究目的探討miR-125a-3p在RV感染細胞后下調的真實性,尋找該分子的作用靶點,相互作用機制及在RV復制過程中的作用關系。研究方法:用RV毒株(ZTR-68)G1P[8]型(源于流行地區(qū)的致病毒株)感染MA104細胞(恒河猴腎細胞,對RV敏感)后,檢測宿細胞miRNAs的表達譜,深度測序確定表達差異的miRNA分子。用miRanda軟件進行比較預測尋找miRNAs可能作用靶點。經(jīng)雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miRNA分子與其靶基因的關系,進一步利用體外轉染該分子模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor)評價下游靶基因的表達。RT-qPCR、免疫熒光等方法檢測靶基因的表達,以及通過上下調靶基因檢測RV的復制情況。用免疫共沉淀法探測了靶基因與RV相互作用關系的結合位點。研究結果:RV感染MA104細胞后,miRNAs有表達差異,深度測序表示:該差異分子為miR-125a-3p,且miR-125a-3p能夠抑制RV的復制;miRanda預測提示多聚嘧啶結合蛋白(PTB)是該分子的可能靶點。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實二者存在靶定關系,經(jīng)過表達和抑制表達miR-125a-3p發(fā)現(xiàn),miR-125a-3p能下調PTB的表達;PTB在感染早期定位于胞核,后期遷移出至胞質。通過調節(jié)PTB的表達試驗證實,PTB能促進RV復制。經(jīng)免疫共沉淀試驗明確了 PTB作用于RV非結構蛋白NSP3,二者協(xié)同促進病毒的復制。結論:miR-125a-3p是宿主細胞抗病毒復制的主要因素,對病毒復制起到抑制作用。RV感染細胞后,通過下調宿主細胞miR-125a-3p表達,解除對靶基因PTB的抑制,影響宿主細胞蛋白翻譯以促進病毒自身蛋白的翻譯,裝配形成完整的子代病毒。該研究結果有助于了解揭示RV感染細胞復制機理,也可為尋找抗RV藥物靶點提供線索。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

胞和乳腺癌細胞ＭＣＦ－７中呈現(xiàn)高表達情況，在疫苗生產(chǎn)用Ｖｅｒｏ細胞中ＰＴＢ表達水逡逑平也很高，但在ＫＭＢ１７細胞和人臍帶間充質干細胞中表達水平很低，在大鼠的神逡逑經(jīng)干細胞中不表達ＰＴＢ邋（圖１）。逡逑７逡逑

相應病毒蛋白的表達，說明ＭＡ１０４細胞和ＫＭＢ１７細胞表面均具有ＲＶ感染的必須逡逑受體。但在病毒感染１６ｈ后，ＫＭＢ１７細胞中檢測到的輪狀病毒蛋白表達量與ＭＡ１０４逡逑細胞和Ｖｅｒｏ細胞中的病毒蛋白表達量有明顯差異（圖２）。將野毒株ＺＴＲ－６８感染逡逑ＭＡ１０４細胞和ＫＭＢ１７細胞后進行連續(xù)傳代，ＺＴＲ－６８株無法適應生長于ＫＭＢ１７細逡逑胞。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結果表明，ＰＴＢ在ＭＡ１０４細胞和Ｖｅｒｏ細胞中高表達，而在ＫＭＢ１７逡逑細胞中表達水平很低（圖３）。這一結果提示我們，ＰＴＢ可能與輪狀病毒在不同宿主逡逑細胞中的感染敏感性有很強的相關性，對輪狀病毒的復制和增殖起到促進作用。逡逑ｓｓＨＩＩＢＨ逡逑ＥＨｈＢＨｈ邐＾逡逑■■逡逑圖２輪狀病毒ＺＴＲ－６８感染ＭＡ１０４邋（Ａ、Ｂ）和ＫＭＢ１７邋（Ｃ、Ｄ）細胞１６ｈ后檢測病毒蛋逡逑白逡逑Ｈｅｌａ邋ＭＡ１０４邐ＭＡ１０４邋ＫＭＢ１７邋ＫＭＢ１７逡逑Ｐ３５邐Ｐ４０邐Ｐ４０邐Ｐ５０逡逑圖３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＰＴＢ在ＭＡ１０４和ＫＭＢ邋１７細胞中的表達量逡逑通過免疫熒光檢測感染ＥＶ７１，ＣＡ１６，腺病毒及輪狀病毒后ＰＴＢ蛋白的表達及逡逑８逡逑

ＭＡ１０４細胞和ＫＭＢ１７細胞后進行連續(xù)傳代，ＺＴＲ－６８株無法適應生長于ＫＭＢ１７細逡逑胞。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結果表明，ＰＴＢ在ＭＡ１０４細胞和Ｖｅｒｏ細胞中高表達，而在ＫＭＢ１７逡逑細胞中表達水平很低（圖３）。這一結果提示我們，ＰＴＢ可能與輪狀病毒在不同宿主逡逑細胞中的感染敏感性有很強的相關性，對輪狀病毒的復制和增殖起到促進作用。逡逑ｓｓＨＩＩＢＨ逡逑ＥＨｈＢＨｈ邐＾逡逑■■逡逑圖２輪狀病毒ＺＴＲ－６８感染ＭＡ１０４邋（Ａ、Ｂ）和ＫＭＢ１７邋（Ｃ、Ｄ）細胞１６ｈ后檢測病毒蛋逡逑白逡逑Ｈｅｌａ邋ＭＡ１０４邐ＭＡ１０４邋ＫＭＢ１７邋ＫＭＢ１７逡逑Ｐ３５邐Ｐ４０邐Ｐ４０邐Ｐ５０逡逑圖３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＰＴＢ在ＭＡ１０４和ＫＭＢ邋１７細胞中的表達量逡逑通過免疫熒光檢測感染ＥＶ７１，ＣＡ１６，腺病毒及輪狀病毒后ＰＴＢ蛋白的表達及逡逑８逡逑

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