海藻糖因其穩(wěn)定性好和對(duì)生物大分子具有非特異性保護(hù)作用等特點(diǎn),近年來在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)中被廣泛使用。目前,工業(yè)上海藻糖的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、微生物抽提法、酶轉(zhuǎn)化法和轉(zhuǎn)基因法等。在酶轉(zhuǎn)化法中,海藻糖合酶能一步催化麥芽糖生成海藻糖,由于具有工藝流程短、易調(diào)控、生產(chǎn)原料低廉等優(yōu)點(diǎn),從而在工業(yè)生產(chǎn)中具有較高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。本文將一種來源于60℃、pH0.7環(huán)境中的耐熱嗜酸古菌(Picrophilus torridus)的海藻糖合酶基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行克隆表達(dá),并探索了一種快速簡(jiǎn)單高效的海藻糖合酶固定化方法。主要研究工作如下:1.依照大腸桿菌密碼子偏好性,將海藻糖合酶基因(GenBank:AE017261)進(jìn)行優(yōu)化,合成了一段基因大小為1677 bp的海藻糖合酶(TreS)片段。在兩端設(shè)計(jì)的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)雙酶切后,連接至pET-28a(+)載體上,構(gòu)建得表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-TreS,并轉(zhuǎn)化在大腸桿菌BL21,得到大腸桿菌工程菌株。該工程菌誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白的分子量約為65 kDa,誘導(dǎo)劑IPTG的最適添加量0.1 mmol/L,最適誘導(dǎo)溫度20℃,最適誘導(dǎo)時(shí)間12 h;薄層色譜(TLC)結(jié)果說明重組菌株經(jīng)誘導(dǎo)后的粗酶液具有催化麥芽糖生成海藻糖的酶活性;將粗酶液純化后,高效液相色譜(HPLC)結(jié)果進(jìn)一步說明純化酶也具有催化麥芽糖生成海藻糖的能力。2.為研究不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物表達(dá)水平的影響,利用Gibson法將該海藻糖合酶片段連接到質(zhì)粒pPICZαA的EcoRⅠ位點(diǎn)上,構(gòu)建表達(dá)載體pPICZαA-TreS,同源重組到畢赤酵母GS115基因組中,篩選出高拷貝菌株后,利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),TLC結(jié)果表明在畢赤酵母胞內(nèi)和胞外都檢測(cè)到海藻糖合酶活性。3.利用殼聚糖作為載體,對(duì)大腸桿菌表達(dá)純化后的海藻糖合酶進(jìn)行固定化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,最適海藻糖合酶加入量為32 mg/g(殼聚糖),最適吸附時(shí)間為2.5 h;經(jīng)過9次重復(fù)試驗(yàn),固定化酶酶活殘留率為64.64%;與游離酶相比,固定化酶溫度穩(wěn)定性沒有明顯變化,但酸堿穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶;反應(yīng)進(jìn)程試驗(yàn)結(jié)果表明,該固定化酶在反應(yīng)2 h時(shí),海藻糖得率達(dá)最大61.4%。
【學(xué)位單位】：湖北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;Q814
【部分圖文】：

1 The biosynthetic pathway of intracellular trahalose in SaccharcerevisiaeTreY-TreZ 途徑：該途徑由麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTS麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase，TreZ 基因編碼）共同 MTSase 的催化下，麥芽糊精末端兩分子葡萄糖之間的糖苷為 α,α-1,1 糖苷鍵，使麥芽糊精成為麥芽寡糖基海藻糖；再麥芽寡糖基海藻糖被水解為麥芽糊精（減少了兩個(gè)葡萄糖基藻糖，該途徑已在節(jié)桿菌、根瘤菌、硫磺礦硫化葉菌及結(jié)反應(yīng)式如圖 1.2 所示。圖 1.2 TreY-TreZ 海藻糖合成途徑ig. 1.2 The intracellular trahalose synthesis pathway of TreY-Tr

圖 1.1 釀酒酵母中胞內(nèi)海藻糖合成途徑 The biosynthetic pathway of intracellular trahalose in SaccharcerevisiaeeY-TreZ 途徑：該途徑由麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSa芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase，TreZ 基因編碼）共同TSase 的催化下，麥芽糊精末端兩分子葡萄糖之間的糖苷 α,α-1,1 糖苷鍵，使麥芽糊精成為麥芽寡糖基海藻糖；再芽寡糖基海藻糖被水解為麥芽糊精（減少了兩個(gè)葡萄糖基糖，該途徑已在節(jié)桿菌、根瘤菌、硫磺礦硫化葉菌及結(jié)反應(yīng)式如圖 1.2 所示。

固定化酶1953 年德國(guó)的 GRUBHOFER N 等首次提出固定化酶概念。它是一種經(jīng)物方法處理，限制在一定的空間范圍內(nèi)，可以反復(fù)使用而又能發(fā)揮催化作劑。許多研究已經(jīng)證明，固定是改善酶特性的有效方法，如穩(wěn)定性、活性、特異性和降低抑制[54]。同自由酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)酶可反復(fù)使用；極易與底物和產(chǎn)物分開，產(chǎn)物純度高；反應(yīng)條件易于控小型化，可節(jié)約能源；可連續(xù)化和自動(dòng)化生產(chǎn)，節(jié)約勞動(dòng)力等。在 196的TOSAT等首次在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用固定化氨基�；敢訢L-氨基酸為底產(chǎn) L-氨基酸，實(shí)現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革，這是固定化酶從實(shí)驗(yàn)室研工業(yè)化生產(chǎn)的重大轉(zhuǎn)折，此后固定化酶的研究得到了飛速的發(fā)展[55]。酶的固定化技術(shù)主要包括交聯(lián)、吸附、包埋和共價(jià)結(jié)合（化學(xué)偶聯(lián)）[5法（圖 1.3 列舉了部分酶的固定化技術(shù)）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2830802