[目的]對黑曲霉纖維二糖水解酶cbhA基因進(jìn)行了克隆和在畢赤酵母中的真核表達(dá)。[方法]采用PCR方法擴(kuò)增黑曲霉纖維二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,獲得的DNA序列與cbhA基因表現(xiàn)出高度相似,推導(dǎo)出的氨基酸序列與真菌CBHA酶也高度相似,屬于糖基水解酶第7家族。將擴(kuò)增得到的cbhA基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上,與α-因子信號肽序列形成融合蛋白,進(jìn)一步通過電轉(zhuǎn)化方法將線性化質(zhì)粒p PIC9K-cbhA轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115菌株進(jìn)行表達(dá)。[結(jié)果]在甲醇誘導(dǎo)下,重組菌株CMC比酶活力是對照的2.5倍,SDS-PAGE分析結(jié)果也確認(rèn)了cbhA基因在重組菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表達(dá)。對該酶性質(zhì)的分析表明,重組CBHA酶水解CMC底物最適p H值為5.0,最適溫度為55℃。[結(jié)論]黑曲霉纖維二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表達(dá)工程菌株的構(gòu)建,為獲得纖維二糖水解酶A高產(chǎn)菌株,實(shí)現(xiàn)纖維素酶多組分的人工組裝奠定了基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

A在畢赤酵母中異源表達(dá)1．2．6重組CBHA酶特性研究使用羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)為底物進(jìn)行CBHA酶活力的測定［20］。酵母重組子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每24h補(bǔ)加1%的甲醇，發(fā)酵液離心后上清液作為粗酶液，在不同的發(fā)酵時間測定粗酶液的CMC酶活力。分別在不同pH(1．5～7．5)和不同溫度(30～70℃)條件下，測定重組CBHA酶的CMC酶活力。2結(jié)果與分析2．1黑曲霉纖維二糖水解酶cbhA基因的克隆及序列分析以提取得到的黑曲霉基因組DNA為模板，按方法1．3所述克隆得到黑曲霉纖維二糖水解酶cbhA基因序列，電泳結(jié)果如圖1顯示在1500bp左右獲得一條明亮條帶，條帶長度與預(yù)期設(shè)計(jì)的大小吻合(黑曲霉cbhA序列全長1514bp)。擴(kuò)增得到的cb-hA基因序列已經(jīng)提交NCBIGenBank，編號為KT886077。預(yù)測氨基酸序列452aa，通過ComputepI/Mw在線預(yù)測，該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為4．20，分子量為48．3kDa。在Uniprot網(wǎng)站上在線比對該氨基酸序列，與A．niger的Glucanase(由cbhⅠ基因編碼，UniprotNo．F2YWN5)高度同源，相似度達(dá)到98．9%，該蛋白屬于糖基水解酶第7家族(GH7fam-ily)，氨基酸序列同源性比對結(jié)果見圖2。另外，該序列與Aspergilluskawachii的Glucanase(G7XEI8)親源關(guān)系較近近，相似度為97．8%;而與Aspergillusni-ger的cellobiohydrolaseA(A2QPG2)的相似度為94．2%。通過SWISS－MODEL在線預(yù)測該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CBHA與CBHⅠ的催化結(jié)構(gòu)域(CatalyticDomin，CD域)相似度為72．06%，圖3所示為預(yù)測的CBHA三級結(jié)構(gòu)模型。圖1黑曲霉cbhA基因的PCＲ擴(kuò)增電泳圖Fig．1ThePCＲamplificationelectrophoresisofcbhAfromAspergillusniger2．2含cbhA基因的畢赤酵母載體的構(gòu)建及鑒定按照1．2．2中所述方法，對cbhA基因表達(dá)載體的進(jìn)行構(gòu)建和測序驗(yàn)證?

得到黑曲霉纖維二糖水解酶cbhA基因序列，電泳結(jié)果如圖1顯示在1500bp左右獲得一條明亮條帶，條帶長度與預(yù)期設(shè)計(jì)的大小吻合(黑曲霉cbhA序列全長1514bp)。擴(kuò)增得到的cb-hA基因序列已經(jīng)提交NCBIGenBank，編號為KT886077。預(yù)測氨基酸序列452aa，通過ComputepI/Mw在線預(yù)測，該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為4．20，分子量為48．3kDa。在Uniprot網(wǎng)站上在線比對該氨基酸序列，與A．niger的Glucanase(由cbhⅠ基因編碼，UniprotNo．F2YWN5)高度同源，相似度達(dá)到98．9%，該蛋白屬于糖基水解酶第7家族(GH7fam-ily)，氨基酸序列同源性比對結(jié)果見圖2。另外，該序列與Aspergilluskawachii的Glucanase(G7XEI8)親源關(guān)系較近近，相似度為97．8%;而與Aspergillusni-ger的cellobiohydrolaseA(A2QPG2)的相似度為94．2%。通過SWISS－MODEL在線預(yù)測該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CBHA與CBHⅠ的催化結(jié)構(gòu)域(CatalyticDomin，CD域)相似度為72．06%，圖3所示為預(yù)測的CBHA三級結(jié)構(gòu)模型。圖1黑曲霉cbhA基因的PCＲ擴(kuò)增電泳圖Fig．1ThePCＲamplificationelectrophoresisofcbhAfromAspergillusniger2．2含cbhA基因的畢赤酵母載體的構(gòu)建及鑒定按照1．2．2中所述方法，對cbhA基因表達(dá)載體的進(jìn)行構(gòu)建和測序驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的是單酶切位點(diǎn)連入載體，而只有同pPIC9K載體的啟動子序列正向連接的序列才可以正確表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，1為正向連接的pPIC9K－cbhA質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切得到9．431kb和1．33kb兩個片段，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2基于氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2Phylogenetictreebasedontheaminoacidsequencesofthecellobiohydolases2．3重組畢赤酵母的篩選和鑒定用無菌水洗脫MD平板上長出的轉(zhuǎn)化子，將其均勻涂布在含不同G418濃度的YPD－G418平板上。pPIC9K整合入畢赤酵母

生物技術(shù)2017年圖3CBHA三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig．3Thepredicted3－DimensionalstructureoftheCBHAenzyme圖4重組pPIC9K－cbhA質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切電泳圖Fig．4TheBamHⅠenzymedigestionspectrumofrecombinantplasmidpPIC9K－cbhA菌濃，并取出10mL發(fā)酵液，離心后上清液作為粗酶液，測定其CMC酶活力。如圖5所示，為重組酵母轉(zhuǎn)化子P．pastoris/cbhA的CMC酶活力時間曲線及菌體生長情況，從圖中可以看出，在84h之內(nèi)，經(jīng)過甘油饑餓培養(yǎng)，進(jìn)入以甲醇為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)階段后，菌體量仍呈上升趨勢，CMC酶活力也一直處于上升趨勢，在60h以內(nèi)CMC酶活力上升的趨勢較平緩，到60h和84h的時候，蛋白表達(dá)量明顯提高。與含有空載體的酵母菌相比，攜有cbhA基因的工程菌株與攜有pPIC9K質(zhì)粒菌株相比，CMC酶活性提高250%。圖5重組畢赤酵母菌株的產(chǎn)酶時間曲線■菌株P(guān)．pastoris/pPIC9K－cbhA與P．pastoris/pPIC9K酵母CMC酶活力比值;◆菌體生長量。Fig．5ThetimecourseoftherelativeCMCactivityproducedbytheengineeredP．pastorisstrain■TherelativeCMCactivityratioofP．pastoris/pPIC9K－cbhAandP．pastoris/pPIC9K;◆bacteriagrowthmass．2．5表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨濃縮和透析除鹽后，將獲得的濃縮粗酶液進(jìn)行SDS－PAGE分析，CBHA預(yù)測蛋白分子量為48．3kDa。結(jié)果如圖6所示，箭頭所指位置在45kDa條帶上方有1條明顯的特異性蛋白條帶(圖中標(biāo)記為2)，而陰性對照pPIC9K/GS115(圖中標(biāo)記為1)誘導(dǎo)上清中在該區(qū)域沒有蛋白條帶，證明目的基因得到成功表達(dá)。圖6重組cbhA基因在畢赤酵母中的表達(dá)1:攜有pPIC9K的酵母轉(zhuǎn)化子;2:攜有pPIC9K－cbhA的酵母轉(zhuǎn)化子;箭頭所示為重組蛋白CBHA。Fig．6SDS－PAGEanalysisoftherecombinantCBHAinP．p

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