九孔鮑(Haliotis diversicolor supertexta)是中國(guó)南方沿海具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海水養(yǎng)殖貝類,20世紀(jì)90年代中后期以來,開始爆發(fā)疾病導(dǎo)致九孔鮑大規(guī)模死亡,給九孔鮑產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,限制了我國(guó)九孔鮑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。種質(zhì)退化是九孔鮑病害爆發(fā)和死亡的主要原因,通過遺傳改良選育出抗性強(qiáng),培育出生長(zhǎng)快的品種是解決九孔鮑病害爆發(fā)和死亡的主要途徑。在分子水平研究生長(zhǎng)相關(guān)基因的分子調(diào)控機(jī)制并篩選與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,有助于培育出抗性強(qiáng)、生長(zhǎng)快的九孔鮑品種。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族(transforming growth factor type beta,TGF-β)是一組具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性的多功能分泌型細(xì)胞因子,參與細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)等多種生物學(xué)過程。肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族(TGF-β)中參與動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子,是經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳改良的重要候選基因;骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族(TGF-β)中最大的分泌型信號(hào)傳導(dǎo)分子,在動(dòng)物的骨骼發(fā)育及器官形成中具有重要作用,BMP-2基因是BMP家族的重要成員,在信號(hào)傳遞、貝殼形成過程中具有重要作用。為探究MSTN、BMP-2基因在九孔鮑中的功能,克隆九孔鮑MSTN、BMP-2基因cDNA全長(zhǎng),利用生物信息學(xué)分析了基因序列和氨基酸特征,并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢了MSTN、BMP-2基因在各組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。為探究九孔鮑MSTN、BMP-2基因的多態(tài)性及生長(zhǎng)相關(guān)性,采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法對(duì)九孔鮑MSTN、BMP-2基因進(jìn)行SNP篩選,并通過基因多態(tài)性與九孔鮑體質(zhì)量、殼長(zhǎng)、殼寬進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了MSTN基因不同基因型九孔鮑的表達(dá)水平。為九孔鮑生長(zhǎng)相關(guān)分子機(jī)制的研究、生長(zhǎng)標(biāo)記的開發(fā)和標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。主要研究結(jié)果如下:1、九孔鮑MSTN基因cDNA克隆及表達(dá)采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從九孔鮑右側(cè)殼肌中獲得了MSTN基因cDNA全長(zhǎng)3755 bp,其中5′非編碼區(qū)(5′UTR)324 bp,3′非編碼區(qū)(3′UTR)1985 bp,開放閱讀框(ORF)1446 bp,編碼481個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為54.96 ku,理論等電點(diǎn)pI:9.41;具有N端信號(hào)肽(1-17aa)、TGF-β前肽區(qū)域(157-367aa)和成熟肽區(qū)域(379-481aa),以及蛋白酶水解位點(diǎn)RRPR(364-368 aa)和C末端生物活性區(qū)9個(gè)保守的半胱氨酸殘基,符合TGF-β超家族蛋白典型結(jié)構(gòu)特征,且預(yù)測(cè)到2個(gè)新的蛋白酶水解位點(diǎn)RQRR(120-124 aa)、RYRR(235-239 aa)。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示九孔鮑MSTN基因和紅鮑MSTN基因聚為一支。qRT-PCR結(jié)果表明,九孔鮑MSTN基因在檢測(cè)的6個(gè)組織均表達(dá)且在足、右側(cè)殼肌、外套膜中高表達(dá),在鰓、性腺、肝臟中低表達(dá);在檢測(cè)的7個(gè)發(fā)育時(shí)期均表達(dá)且在受精卵、原腸胚、稚鮑時(shí)期高表達(dá),在卵、4細(xì)胞、8細(xì)胞時(shí)期、幼鮑時(shí)期表達(dá)量較低。研究表明MSTN基因可能在九孔鮑肌肉生長(zhǎng)中具有重要作用。2、九孔鮑BMP-2基因cDNA克隆及表達(dá)采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從九孔鮑外套膜中獲得了BMP-2基因cDNA全長(zhǎng)2572 bp,其中5′非編碼區(qū)(5′UTR)123 bp,3′非編碼區(qū)(3′UTR)1150 bp,開放閱讀框(ORF)為1299 bp,編碼432個(gè)氨基酸,其分子質(zhì)量為48.59 ku,理論等電點(diǎn)(pI)為9.84;具有N端信號(hào)肽(1-39 aa)、TGF-β前肽區(qū)域(63-294 aa)和TGF-β成熟肽區(qū)域(331-432 aa),以及蛋白酶水解位點(diǎn)RLRR(272-275 aa)和7個(gè)保守的半胱氨酸殘基,符合TGF-β超家族蛋白典型結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示九孔鮑BMP-2基因和耳鮑聚為一支。qRT-PCR結(jié)果表明,BMP-2基因在九孔鮑的6個(gè)組織中均有表達(dá),在足、右側(cè)殼肌、外套膜及肝臟中顯著高表達(dá);在檢測(cè)的7個(gè)發(fā)育時(shí)期均表達(dá),其中在受精卵、4細(xì)胞、8細(xì)胞、原腸胚、稚鮑時(shí)期表達(dá)量顯著高于卵、幼鮑時(shí)期。研究表明BMP-2基因可能在九孔鮑貝殼形成中具有重要作用。3、九孔鮑MSTN基因多態(tài)性及與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析實(shí)驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法在九孔鮑MSTN基因中,共篩選出了9個(gè)SNP位點(diǎn),5′非編碼區(qū)(5′UTR)1個(gè)SNP位點(diǎn)為g252GA;開放閱讀框(ORF)4個(gè)SNP位點(diǎn)為g414AC、g558CA、g909CT和g960AT;3′非編碼區(qū)(3′UTR)4個(gè)SNP位點(diǎn)為g2148GA、g2164AG、g2420CG和g2520CG,9個(gè)SNP位點(diǎn)均檢測(cè)到3種基因型。其中開放閱讀框中的4個(gè)SNP位點(diǎn)突變均不改變所編碼的氨基酸,為同義突變,九孔鮑MSTN基因9個(gè)SNP位點(diǎn)的期望雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)分別在0.2155-0.4778和0.2195-0.4471間,多態(tài)信息含量(PIC)的范圍為0.1913-0.3621,除g2164AG為低度多態(tài)性外,其余均為中度多態(tài)性。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢驗(yàn)結(jié)果表明,除g2420CG位點(diǎn)外,其余8個(gè)SNP位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格平衡。SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示九孔鮑MSTN基因編碼區(qū)SNP位點(diǎn)g909CT發(fā)生C/T同義突變,與九孔鮑體質(zhì)量、殼長(zhǎng)、殼寬顯著相關(guān),TT基因型九孔鮑的體質(zhì)量顯著高于CC基因型和TC基因型的個(gè)體,TT基因型的殼長(zhǎng)、殼寬顯著高于CC基因型(P0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,在九孔鮑MSTN基因SNP位點(diǎn)g909CT 3種基因型中,TC和CC基因型的基因表達(dá)量顯著高于TT基因型(P(27)0.05)。研究結(jié)果表明MSTN基因SNP位點(diǎn)可作為九孔鮑標(biāo)記輔助選擇育種重要候選標(biāo)記。4、九孔鮑BMP-2基因多態(tài)性及與生長(zhǎng)相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法在九孔鮑BMP-2基因中共篩選出了4個(gè)SNP位點(diǎn),開放閱讀框2個(gè)SNP位點(diǎn)為g1176GA、g1275CT;3′非編碼區(qū)2個(gè)SNP位點(diǎn)為g1436GT、g1506GT,4個(gè)SNP位點(diǎn)的期望雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)分別在0.1287-0.3895和0.1713-0.4762間,多態(tài)信息含量(PIC)的范圍為0.1560-0.3615。研究結(jié)果表明九孔鮑實(shí)驗(yàn)的群體為中度遺傳多樣性,在九孔鮑BMP-2基因篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn),為九孔鮑標(biāo)記輔助選擇育種提供參考資料。
【學(xué)位單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

182.2.2 MSTN 基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析運(yùn)用 NCBI 在線 Blastx 比對(duì)，結(jié)果表明：九孔鮑 MSTN 氨基酸序列與紅鮑(Haliotisrufescens)相似性最高，為 76%，與其他物種相似性較低�；� NJ 法構(gòu)建 MSTN 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示：所有魚類和無脊椎動(dòng)物先聚類隨后聚在一起形成一簇，哺乳動(dòng)物單獨(dú)聚類為一簇。在無脊椎動(dòng)物中，九孔鮑、紅鮑、蝦夷扇貝；凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei)、墨吉明對(duì)蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)；瘤背石磺(Onchidium struma)、縊蟶(Sinonovacula constricta)、合浦珠母貝 (Pinctada martens)、紫扇貝(Argopecten purpuratus)；各聚為一支(圖 2-3)。圖 2-2b 九孔鮑 MSTN 基因預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)(A）、三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)和結(jié)構(gòu)域(C)Fig .2-2b The prediction of MSTN secondary structure(A) and tertiary structure(B) and structuraldomain(C) H. diversicolor supertexta

28圖 3-2 BMP-2 氨基酸序列比對(duì)蛋白酶水解位點(diǎn)(RXXR），單下劃線標(biāo)注 TGF-β 前肽區(qū)域，雙下劃線標(biāo)注成熟區(qū)域ultiple sequences alignment of BMP-2 amino acid squences from differentspeciescessing site(RXXR）are show in the boxed，the predicted TGF-β prepetide domain and TGF-βomain are show in single underline and double underline respectively

3.2.3 BMP-2 基因表達(dá)分析通過熒光定量 PCR 分析 HS-BMP-2 基因在各組織和顯示：BMP-2 基因在九孔鮑 6 個(gè)組織中均有表達(dá)，在足中高表達(dá)，在性腺、鰓中低表達(dá)(P<0.05) (圖 3-5a)；在檢BMP-2 基因在九孔鮑受精卵時(shí)期表達(dá)量最高，其次是受胚、稚鮑時(shí)期，在卵、幼鮑時(shí)期表達(dá)量最低(P<0.05) (圖圖 3-4 基于 NJ 法構(gòu)建 BMP-2 氨基酸序列系Fig.3-4 Phylogenetic tree of BMP-2 was constructed usingmethod50100bbbb量expressionn

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2829541