性發(fā)育是個體成熟并獲得生殖能力的過程,受到遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境等多種因素的影響。性發(fā)育的調控依賴于一個有多條通路共同組成的復雜基因網絡。本課題組前期在近交系小鼠的X染色體上發(fā)現了一個推遲小鼠性發(fā)育啟動的基因miR-505,實驗證明絲氨酸/精氨酸富集的剪接因子1(SRSF1)就是miR-505的靶基因,并且SRSF1能夠緩解miR-505對性發(fā)育相關基因促性腺激素釋放激素(Gn RH)、Kiss1的抑制作用。本研究基于上述背景,在GT1-7細胞中,利用短發(fā)夾RNA(sh RNA)慢病毒構建低表達SRSF1的穩(wěn)轉株,確定SRSF1與性發(fā)育相關基因GnRH、Kiss1之間的關系。利用敲低SRSF1的穩(wěn)轉株和pGT1-7細胞進行RNA測序(RNA-seq)和蛋白質組學的研究,找到SRSF1參與影響性發(fā)育相關基因的信號通路,并初步探索miR-505和SRSF1影響性發(fā)育相關基因的分子機制。構建SRSF1敲低的穩(wěn)轉株,用包含SRSF1-shRNA載體的慢病毒感染小鼠下丘腦永生化的神經元細胞GT1-7,獲得穩(wěn)定敲低SRSF1的細胞株。并檢測穩(wěn)轉株中性發(fā)育相關基因GnRH、Kiss1的表達量。在mRNA水平,用高通量的測序轉錄組分析技術——RNA-seq對穩(wěn)轉株進行表達譜檢測。并用生物信息學對測序結果進行分析,用TopHat將reads比對到基因組上,比對上的reads經過Cufflinks形成轉錄本,Cuffdiff對這些轉錄本進行分析得到差異表達的基因。后續(xù)對這些差異基因進行GO分析和KEGG pathway分析。在蛋白質水平,用高通量篩選技術——穩(wěn)定同位素標記的相對和絕對定量技術(iTRAQ)對穩(wěn)轉株進行差異蛋白的篩選。并用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件對差異蛋白進行分子功能、基因網絡和信號通路的分析。Real-time PCR和Western blot檢測GT1-7細胞中SRSF1在mRNA和蛋白水平的變化,發(fā)現SRSF1敲低效率分別為45%(P0.001)和42%(P0.05),即成功構建了敲低SRSF1的穩(wěn)轉株shRNA-SRSF1-GT1-7。穩(wěn)轉株中性發(fā)育相關基因GnRH、Kiss1在mRNA水平分別降低35%(P0.01)和46%(P0.001)。說明SRFS1影響了性發(fā)育相關基因的表達。RNA-seq在shRNA-GT1-7-SRSF1細胞中共檢測到3161個表達差異的基因,其中上調的有1407個,下調的有1754個。在過表達mir-505的細胞pGT1-7中共檢測到3034個表達差異的基因,其中上調的有1357個,下調的有1677個。兩種細胞中的差異基因大多數位于細胞質,具有結合、激活的功能。在KEGG分析中,代謝通路、癌癥通路、γ-氨基丁酸能突觸、PI3K-Akt信號通路在兩種細胞中都被富集到,pGT1-7細胞的差異基因還參與胰島素分泌和GnRH信號。iTRAQ在兩種細胞中檢測到了4945個蛋白質,shRNA-GT1-7-SRSF1中有102個差異蛋白質(fold change在1.3倍之上,p值小于0.05),pGT1-7中有173個差異蛋白質(fold change在1.3倍之上,p值小于0.05)。這些差異蛋白有一半以上位于胞質,同RNA-seq。shRNA-GT1-7-SRSF1中的差異蛋白主要參與γ-氨基丁酸降解的信號通路、胰島素受體信號通路及AMPK信號通路。在pGT1-7細胞中γ-氨基丁酸降解的信號通路和PI3K-Akt信號通路被富集到。通過Real-time PCR驗證,說明RNA-seq和iTRAQ的結果較為可靠。綜上所述,我們推測SRSF1可能是通過γ-氨基丁酸降解信號通路、AMPK信號通路和PI3K-Akt信號通路發(fā)揮功能。這個研究為后續(xù)更深入的解析SRSF1影響性發(fā)育的分子機制研究提供一個理論基礎。
【學位單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q756
【部分圖文】：

因如

在凍存管上記錄好細胞名稱，凍存日期，凍存火后，用封口膜封口，放入凍存盒。把凍存盒放入-凍存管，放入液氮中，記錄好放入的位子，方便日后建導 shRNA 的獲得載體由和元生物技術（上海）有限公司構建，首先針對 shRNA 干 擾 片 段 ， 將 該 干 擾 片 段 插 入 慢PR-U6-shRNA 中，載體如圖 2.1。該載體含有 CMV色熒光蛋白基因 mcHerry 和嘌呤霉素抗性基因 Puro。同時 CMV 啟動紅色熒光蛋白基因和嘌呤霉素抗性察載體感染病毒的效率，嘌呤霉素抗性方便篩選目的的慢病毒載體由和元生物技術（上海）有限公司進行的滴度為 shRNA-1： 4.42E+08；shRNA-2：2.92E+

圖 2-2 RNA-seq 測注：圖片來源為公司合同。2.2.7.1 樣品的準備按 2.2.3 描述的方法抽提 RNA，N所示。用冰袋寄送樣品。表 2-10 RNA樣品 濃度GT1-7 435 ng/μGT1-7 430 ng/μshRNA-SRSF1-GT1-7 599 ng/μshRNA-SRSF1-GT1-7 594 ng/μpGT1-7 471 ng/μpGT1-7 478 ng/μ

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本文編號：2823898