性發(fā)育是個(gè)體成熟并獲得生殖能力的過(guò)程,受到遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等多種因素的影響。性發(fā)育的調(diào)控依賴(lài)于一個(gè)有多條通路共同組成的復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)。本課題組前期在近交系小鼠的X染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)推遲小鼠性發(fā)育啟動(dòng)的基因miR-505,實(shí)驗(yàn)證明絲氨酸/精氨酸富集的剪接因子1(SRSF1)就是miR-505的靶基因,并且SRSF1能夠緩解miR-505對(duì)性發(fā)育相關(guān)基因促性腺激素釋放激素(Gn RH)、Kiss1的抑制作用。本研究基于上述背景,在GT1-7細(xì)胞中,利用短發(fā)夾RNA(sh RNA)慢病毒構(gòu)建低表達(dá)SRSF1的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,確定SRSF1與性發(fā)育相關(guān)基因GnRH、Kiss1之間的關(guān)系。利用敲低SRSF1的穩(wěn)轉(zhuǎn)株和pGT1-7細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序(RNA-seq)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,找到SRSF1參與影響性發(fā)育相關(guān)基因的信號(hào)通路,并初步探索miR-505和SRSF1影響性發(fā)育相關(guān)基因的分子機(jī)制。構(gòu)建SRSF1敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,用包含SRSF1-shRNA載體的慢病毒感染小鼠下丘腦永生化的神經(jīng)元細(xì)胞GT1-7,獲得穩(wěn)定敲低SRSF1的細(xì)胞株。并檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中性發(fā)育相關(guān)基因GnRH、Kiss1的表達(dá)量。在mRNA水平,用高通量的測(cè)序轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)——RNA-seq對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行表達(dá)譜檢測(cè)。并用生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,用TopHat將reads比對(duì)到基因組上,比對(duì)上的reads經(jīng)過(guò)Cufflinks形成轉(zhuǎn)錄本,Cuffdiff對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析得到差異表達(dá)的基因。后續(xù)對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析。在蛋白質(zhì)水平,用高通量篩選技術(shù)——穩(wěn)定同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行差異蛋白的篩選。并用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行分子功能、基因網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路的分析。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)GT1-7細(xì)胞中SRSF1在mRNA和蛋白水平的變化,發(fā)現(xiàn)SRSF1敲低效率分別為45%(P0.001)和42%(P0.05),即成功構(gòu)建了敲低SRSF1的穩(wěn)轉(zhuǎn)株shRNA-SRSF1-GT1-7。穩(wěn)轉(zhuǎn)株中性發(fā)育相關(guān)基因GnRH、Kiss1在mRNA水平分別降低35%(P0.01)和46%(P0.001)。說(shuō)明SRFS1影響了性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。RNA-seq在shRNA-GT1-7-SRSF1細(xì)胞中共檢測(cè)到3161個(gè)表達(dá)差異的基因,其中上調(diào)的有1407個(gè),下調(diào)的有1754個(gè)。在過(guò)表達(dá)mir-505的細(xì)胞pGT1-7中共檢測(cè)到3034個(gè)表達(dá)差異的基因,其中上調(diào)的有1357個(gè),下調(diào)的有1677個(gè)。兩種細(xì)胞中的差異基因大多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì),具有結(jié)合、激活的功能。在KEGG分析中,代謝通路、癌癥通路、γ-氨基丁酸能突觸、PI3K-Akt信號(hào)通路在兩種細(xì)胞中都被富集到,pGT1-7細(xì)胞的差異基因還參與胰島素分泌和GnRH信號(hào)。iTRAQ在兩種細(xì)胞中檢測(cè)到了4945個(gè)蛋白質(zhì),shRNA-GT1-7-SRSF1中有102個(gè)差異蛋白質(zhì)(fold change在1.3倍之上,p值小于0.05),pGT1-7中有173個(gè)差異蛋白質(zhì)(fold change在1.3倍之上,p值小于0.05)。這些差異蛋白有一半以上位于胞質(zhì),同RNA-seq。shRNA-GT1-7-SRSF1中的差異蛋白主要參與γ-氨基丁酸降解的信號(hào)通路、胰島素受體信號(hào)通路及AMPK信號(hào)通路。在pGT1-7細(xì)胞中γ-氨基丁酸降解的信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路被富集到。通過(guò)Real-time PCR驗(yàn)證,說(shuō)明RNA-seq和iTRAQ的結(jié)果較為可靠。綜上所述,我們推測(cè)SRSF1可能是通過(guò)γ-氨基丁酸降解信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路發(fā)揮功能。這個(gè)研究為后續(xù)更深入的解析SRSF1影響性發(fā)育的分子機(jī)制研究提供一個(gè)理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：Q756
【部分圖文】：

因如

在凍存管上記錄好細(xì)胞名稱(chēng)，凍存日期，凍存火后，用封口膜封口，放入凍存盒。把凍存盒放入-凍存管，放入液氮中，記錄好放入的位子，方便日后建導(dǎo) shRNA 的獲得載體由和元生物技術(shù)（上海）有限公司構(gòu)建，首先針對(duì) shRNA 干 擾 片 段 ， 將 該 干 擾 片 段 插 入 慢PR-U6-shRNA 中，載體如圖 2.1。該載體含有 CMV色熒光蛋白基因 mcHerry 和嘌呤霉素抗性基因 Puro。同時(shí) CMV 啟動(dòng)紅色熒光蛋白基因和嘌呤霉素抗性察載體感染病毒的效率，嘌呤霉素抗性方便篩選目的的慢病毒載體由和元生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行的滴度為 shRNA-1： 4.42E+08；shRNA-2：2.92E+

圖 2-2 RNA-seq 測(cè)注：圖片來(lái)源為公司合同。2.2.7.1 樣品的準(zhǔn)備按 2.2.3 描述的方法抽提 RNA，N所示。用冰袋寄送樣品。表 2-10 RNA樣品 濃度GT1-7 435 ng/μGT1-7 430 ng/μshRNA-SRSF1-GT1-7 599 ng/μshRNA-SRSF1-GT1-7 594 ng/μpGT1-7 471 ng/μpGT1-7 478 ng/μ

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本文編號(hào)：2823898