稻瘟病是一種真菌性水稻病害,嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)。生產(chǎn)上對(duì)稻瘟病的防治主要依靠噴施化學(xué)藥劑,但長期使用化學(xué)試劑將導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)生耐藥性而使得該化學(xué)藥劑失去防治功能,更嚴(yán)重的是危害生態(tài)平衡、影響人類身心健康。而種植具有廣譜持久抗性水稻品種,既可降低水稻的生產(chǎn)成本又可促進(jìn)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。因此,挖掘和鑒定稻瘟病抗性基因資源,分離并克隆廣譜持久稻瘟病抗性基因,對(duì)于研究抗性基因的抗病機(jī)理、解析抗性基因與病原效應(yīng)因子之間的互作機(jī)制以及培育廣譜抗稻瘟病水稻品種都具有十分重要的意義。Jefferson是引自美國的一個(gè)秈稻血緣水稻品種,對(duì)不同來源的42份稻瘟菌生理小種產(chǎn)生抗性。目標(biāo)基因Pi2-2被定位于水稻品種Jefferson第6號(hào)染色體上靠近短臂端著絲粒附近,被界定在標(biāo)記RM19817和AP5659-3之間的0.17 cM范圍內(nèi),物理距離約270 kb,與已克隆的廣譜抗瘟基因Pi9、Pi2、Pi50、Pigm和Piz-t等互為等位基因。在前期BAC末端測序的基礎(chǔ)上分析發(fā)現(xiàn),獲得的兩個(gè)陽性克隆所構(gòu)成的重疊群覆蓋整個(gè)Pi2/9基因位點(diǎn),暗示目的基因Pi2-2被包含在這兩個(gè)克隆中。本研究以廣譜抗稻瘟病水稻品種Jefferson為材料,在前期研究基礎(chǔ)上,測序分析陽性BAC克隆,進(jìn)一步克隆目的基因,分析水稻Pi2/9位點(diǎn)中稻瘟病功能抗性基因的分子進(jìn)化特點(diǎn),同時(shí)利用Pi2-2基因開展分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐。取得結(jié)果如下:1.分離了Pi2-2候選基因并完成了蛋白結(jié)構(gòu)分析。采用同源克隆的策略分離獲得了Pi2-2候選基因的完整序列。Pi2-2候選基因序列全長8601 bp,包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子;基因編碼序列全長3099 bp,編碼一個(gè)包含1032個(gè)氨基酸的CC-NBS-LRR類型親水蛋白。蛋白分子式C_(5184)H_(8402)N_(1428)O_(1536)S_(44),相對(duì)分子質(zhì)量116721.02 Da,理論等電點(diǎn)PI為6.95。2.完成了Pi2-2候選基因(蛋白)的分子進(jìn)化分析。分離得到的Pi2-2候選基因啟動(dòng)子區(qū)相對(duì)Pi9基因啟動(dòng)子而言,有6個(gè)InDel插入,合計(jì)插入了268個(gè)核苷酸,編碼區(qū)序列與Pi9基因的編碼區(qū)序列相似性與同源性同樣高達(dá)99%,僅在第二個(gè)外顯子區(qū)存在個(gè)別SNP突變。Pi2-2蛋白與Pi2蛋白間存在44個(gè)氨基酸的差異,與Pi9蛋白間存在12個(gè)氨基酸差異,與Piz-t蛋白間存在48個(gè)氨基酸的差異,與Pigm和Pi50兩個(gè)蛋白間均存在41個(gè)氨基酸差異。進(jìn)化上與Pi9聚類在一個(gè)簇中,與廣譜抗瘟基因Pi9具有更近的親緣關(guān)系和更高的同源性,氨基酸的差異也主要存在于C端的LRR區(qū)。3.對(duì)候選基因Pi2-2進(jìn)行了CRISPR/Cas9編輯。采用CRISPR/Cas9基因編輯的方法,針對(duì)候選基因Pi2-2設(shè)計(jì)了2個(gè)靶位點(diǎn),通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得Jefferson背景下轉(zhuǎn)基因T_0代植株12株,其中編輯植株6株,有包括缺失和插入5種類型的突變,3株純合突變和3株雜合突變,基因編輯率為50%。第一種突變類型導(dǎo)致基因在突變位點(diǎn)直接刪除1個(gè)氨基酸而不引起其他氨基酸的改變;第二種突變類型、第三種突變類型以及第四種突變類型均導(dǎo)致基因編碼序列提前終止,僅編碼了1022個(gè)氨基酸;第五種突變類型是發(fā)生了非同義突變,僅該位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生改變,而其他位點(diǎn)的氨基酸無變化。目前,獲得了LRR靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株,將用于后續(xù)的稻瘟病抗性分析,驗(yàn)證候選基因功能。4.利用Pi2-2基因開展了水稻稻瘟病抗性定向改良的分子育種實(shí)踐。根據(jù)Pi2-2候選基因的序列,開發(fā)獲得了1對(duì)基于PCR的共顯性DNA標(biāo)記Pi2-2 Pro.1,標(biāo)記在Jefferson基因組中擴(kuò)增出一條大小為701 bp的明顯而穩(wěn)定的條帶,在95份水稻品系基因組中擴(kuò)增出一條450 bp的條帶,所占比率為98.96%。通過對(duì)蜀恢527×Jefferson的BC_1F_1回交群體進(jìn)行輔助選擇效率分析,其對(duì)后代的選擇效率為100%,表明可以利用該標(biāo)記有效地開展抗瘟基因Pi2-2的分子標(biāo)記輔助選擇育種。同時(shí),結(jié)合回交育種方法與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù),以Jefferson為Pi2-2基因供體親本,以E32、He85、CO1403、蜀恢527、桃1B等5份秈稻品系為受體親本及輪回親本,定向改良其稻瘟病抗性,已獲得5個(gè)組合的BC_1F_1群體,為進(jìn)一步培育抗病新品系奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.111.41

【參考文獻(xiàn)】

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