稻瘟病是一種真菌性水稻病害,嚴重影響水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)。生產(chǎn)上對稻瘟病的防治主要依靠噴施化學藥劑,但長期使用化學試劑將導致稻瘟病菌產(chǎn)生耐藥性而使得該化學藥劑失去防治功能,更嚴重的是危害生態(tài)平衡、影響人類身心健康。而種植具有廣譜持久抗性水稻品種,既可降低水稻的生產(chǎn)成本又可促進環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。因此,挖掘和鑒定稻瘟病抗性基因資源,分離并克隆廣譜持久稻瘟病抗性基因,對于研究抗性基因的抗病機理、解析抗性基因與病原效應因子之間的互作機制以及培育廣譜抗稻瘟病水稻品種都具有十分重要的意義。Jefferson是引自美國的一個秈稻血緣水稻品種,對不同來源的42份稻瘟菌生理小種產(chǎn)生抗性。目標基因Pi2-2被定位于水稻品種Jefferson第6號染色體上靠近短臂端著絲粒附近,被界定在標記RM19817和AP5659-3之間的0.17 cM范圍內(nèi),物理距離約270 kb,與已克隆的廣譜抗瘟基因Pi9、Pi2、Pi50、Pigm和Piz-t等互為等位基因。在前期BAC末端測序的基礎上分析發(fā)現(xiàn),獲得的兩個陽性克隆所構成的重疊群覆蓋整個Pi2/9基因位點,暗示目的基因Pi2-2被包含在這兩個克隆中。本研究以廣譜抗稻瘟病水稻品種Jefferson為材料,在前期研究基礎上,測序分析陽性BAC克隆,進一步克隆目的基因,分析水稻Pi2/9位點中稻瘟病功能抗性基因的分子進化特點,同時利用Pi2-2基因開展分子標記輔助選擇育種實踐。取得結果如下:1.分離了Pi2-2候選基因并完成了蛋白結構分析。采用同源克隆的策略分離獲得了Pi2-2候選基因的完整序列。Pi2-2候選基因序列全長8601 bp,包括3個外顯子和2個內(nèi)含子;基因編碼序列全長3099 bp,編碼一個包含1032個氨基酸的CC-NBS-LRR類型親水蛋白。蛋白分子式C_(5184)H_(8402)N_(1428)O_(1536)S_(44),相對分子質(zhì)量116721.02 Da,理論等電點PI為6.95。2.完成了Pi2-2候選基因(蛋白)的分子進化分析。分離得到的Pi2-2候選基因啟動子區(qū)相對Pi9基因啟動子而言,有6個InDel插入,合計插入了268個核苷酸,編碼區(qū)序列與Pi9基因的編碼區(qū)序列相似性與同源性同樣高達99%,僅在第二個外顯子區(qū)存在個別SNP突變。Pi2-2蛋白與Pi2蛋白間存在44個氨基酸的差異,與Pi9蛋白間存在12個氨基酸差異,與Piz-t蛋白間存在48個氨基酸的差異,與Pigm和Pi50兩個蛋白間均存在41個氨基酸差異。進化上與Pi9聚類在一個簇中,與廣譜抗瘟基因Pi9具有更近的親緣關系和更高的同源性,氨基酸的差異也主要存在于C端的LRR區(qū)。3.對候選基因Pi2-2進行了CRISPR/Cas9編輯。采用CRISPR/Cas9基因編輯的方法,針對候選基因Pi2-2設計了2個靶位點,通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化獲得Jefferson背景下轉(zhuǎn)基因T_0代植株12株,其中編輯植株6株,有包括缺失和插入5種類型的突變,3株純合突變和3株雜合突變,基因編輯率為50%。第一種突變類型導致基因在突變位點直接刪除1個氨基酸而不引起其他氨基酸的改變;第二種突變類型、第三種突變類型以及第四種突變類型均導致基因編碼序列提前終止,僅編碼了1022個氨基酸;第五種突變類型是發(fā)生了非同義突變,僅該位點的氨基酸發(fā)生改變,而其他位點的氨基酸無變化。目前,獲得了LRR靶點的轉(zhuǎn)基因植株,將用于后續(xù)的稻瘟病抗性分析,驗證候選基因功能。4.利用Pi2-2基因開展了水稻稻瘟病抗性定向改良的分子育種實踐。根據(jù)Pi2-2候選基因的序列,開發(fā)獲得了1對基于PCR的共顯性DNA標記Pi2-2 Pro.1,標記在Jefferson基因組中擴增出一條大小為701 bp的明顯而穩(wěn)定的條帶,在95份水稻品系基因組中擴增出一條450 bp的條帶,所占比率為98.96%。通過對蜀恢527×Jefferson的BC_1F_1回交群體進行輔助選擇效率分析,其對后代的選擇效率為100%,表明可以利用該標記有效地開展抗瘟基因Pi2-2的分子標記輔助選擇育種。同時,結合回交育種方法與分子標記輔助選擇技術,以Jefferson為Pi2-2基因供體親本,以E32、He85、CO1403、蜀恢527、桃1B等5份秈稻品系為受體親本及輪回親本,定向改良其稻瘟病抗性,已獲得5個組合的BC_1F_1群體,為進一步培育抗病新品系奠定了基礎。
【學位單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S435.111.41

【參考文獻】

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本文編號：2821547