[研究背景]中樞性性早熟(central precocious puberty,CPP)是指由于下丘腦-垂體-性腺軸的提前啟動,女孩在8歲前,男孩在9歲前出現(xiàn)第二性征發(fā)育的兒童內分泌疾病。2010年中國九大城市女童第二性征發(fā)育和初潮年齡調查顯示:女童在8歲前出現(xiàn)乳房發(fā)育者超過10%,而10歲前月經(jīng)來潮者占1.65%。研究表明,性早熟不僅會造成矮身材,影響兒童的正常發(fā)育和社會心理健康,還會導致成年后乳腺癌、子宮內膜癌、肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等的發(fā)病風險顯著增高。因此,兒童性早熟的早期診斷和及時干預,不僅可以使青春發(fā)育回歸正常的生理過程,還可以減少后期相關疾病發(fā)生的風險。青春期啟動時間受遺傳、環(huán)境、種族、營養(yǎng)及社會經(jīng)濟等多方面因素影響,其中遺傳因素起到關鍵性作用。到目前為止,已證實的與CPP相關的致病基因有KISS1、KISS1R、DLK1和MKRN3基因。其中MKRN3基因所致性早熟發(fā)病率相對較高,自2013年在新英格蘭雜志首次報道以來,目前已有多個家系及散發(fā)病例被發(fā)現(xiàn)。[研究目的]1.從遺傳和基因方向入手,通過檢測和分析CPP患兒中MKRN3基因的突變類型和遺傳方式,探討MKRN3基因在中國CPP患兒中的突變規(guī)律。2.通過研究不同MKRN3基因突變所對應的臨床表型,明確基因型與表型的關系,為CPP患兒的精準診療和遺傳咨詢提供理論依據(jù)。[研究設計與方法]1.選取研究對象:選取2015.02-2017.02在江蘇省蘇州大學附屬兒童醫(yī)院內分泌科就診及住院的CPP患兒173例(其中9例為家族性CPP),早青春期患兒43例(其中3例有家族史)為研究對象。CPP診斷參照2015年中華醫(yī)學兒科學分會內分泌遺傳代謝學組發(fā)表的《中樞性性早熟診斷與治療共識》,排除誤服避孕藥,顱內、盆腔、腎上腺等部位的占位性病變和其他內分泌疾病(如Mc Cune-Albright綜合征)引起的性早熟。2.研究內容:收集所有患兒的臨床資料,包括就診年齡、發(fā)病年齡、骨齡、初診時第二性征分期、性腺大小、促性腺激素釋放激素(Gn RH)激發(fā)試驗、家族性CPP患兒的家族史等;在征得患兒及其家屬同意后,同時采集血樣標本。提取血液組織全基因組DNA,用PCR法擴增MKRN3基因片段,純化PCR產(chǎn)物,用Sanger法進行測序。依據(jù)“ACMG基因變異解讀指南”,運用多種計算機軟件及數(shù)據(jù)庫,對MKRN3基因新突變的致病性進行分析,探索MKRN3基因型與CPP臨床表型的相關性。3.研究方法:(1)DNA的提取:采用商品化試劑盒(TIANamp Blood DNA試劑盒,天根生物科技,中國北京),按照說明書方法提取基因組DNA,并對其濃度進行標化。(2)PCR法擴增MKRN3基因:用PCR法擴增MKRN3基因整個編碼區(qū),將其擴增為三個重疊的片段(三對引物序列分別為:CCGGAAGTAGGTAGGAACACAC和TTCAGCAGCCGAGCCAATCA;CTTTCTGGTCGGAAGATGGC和CACCTGCGGATACACCTAAT;TGCAGCGTGGTATGGACAAG和AGAAGCACTGCCTCAACAGC)。純化PCR產(chǎn)物。(3)Sanger法測序:用ABI3730xl系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行分析,并與參考序列進行比對,參考序列由Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得(版本序列號ENST00000314520)。家系患兒若發(fā)現(xiàn)突變,需在其三代以內直系親屬中進行突變位點驗證。(4)新錯義突變的致病性預測:用計算機程序(Poly Phen-2,SIFT,Mutation Taster等)對突變的致病性進行初步預測。(5)基因型與表型相關性分析:依據(jù)“ACMG基因變異解讀指南”,同時運用多種計算機軟件及數(shù)據(jù)庫(如Ex AC Browser,1000Genomes,Clinvar,HGMD等),結合家系分離分析,明確基因變異的人群攜帶率、遺傳方式,以及與臨床表型的相關性。(6)新錯義突變的生物信息學分析:運用計算機軟件(BLAST/PSI-BLAST、MODELLER V9.19、VMD1.9.4)構建MKRN3蛋白的三維結構模型,并分析突變所處的空間位置,從而推斷其對蛋白功能的影響。[研究結果]1.MKRN3基因測序結果:本研究在2個散發(fā)病例(散發(fā)共204個)和5個家系病例(家系共12個)中,檢測出四種MKRN3基因突變,分別為:c.1138GA(p.Glu380Lys)、c.1420TA(p.Leu474Met)、c.673CG(p.Leu225Val)、c.1071CG(p.Ile357Met);其中第一個為新發(fā)錯義突變(父母均無該突變),后三者則為雜合錯義突變(父或母有相同突變)。以上4種突變,目前均無文獻報道,為本研究發(fā)現(xiàn)的新的突變位點。2.MKRN3突變組和非MKRN3突變組的臨床特征相比無明顯差異。3.綜合12個家系病例的基因及臨床資料,進行遺傳學分析提示:c.1138GA(p.Glu380Lys)和c.1071CG(p.Ile357Met)為CPP的可能致病突變;另外兩個錯義突變的臨床意義均不明確。4.MKRN3突變對其蛋白結構及功能影響的生物信息學分析:E380K和I357M均位于鋅離子結合區(qū)域(C3HC4環(huán)狀鋅指區(qū)),而前者由于E(帶負電荷)突變?yōu)镵(帶正電荷),使得其物理化學性質完全改變,氨基酸之間的氫鍵相互作用無法形成,局部結構的穩(wěn)定性被破壞,并可能導致鋅離子結合障礙,故推斷其對MKRN3蛋白功能的表達有顯著影響。[研究結論]1.本研究中MKRN3突變所致CPP的發(fā)生率相對較低,女孩多見,以錯義突變?yōu)橹鳌?.MKRN3突變在家系及散發(fā)CPP病例中均可檢測到,其遺傳方式為常染色體顯性遺傳,有性別依賴的不完全外顯率。3.基于MKRN3突變的印跡遺傳模式,采集病史時不僅要了解母親一方的家族史,更應詳細詢問父系家族史。有男性性早熟家族史的健康兒童,應早期進行遺傳咨詢,以免錯過最佳診療時機。4.可在家族性CPP的患者中常規(guī)進行MKRN3基因檢測。5.無論中國還是國外,Gn RH類似物都是MKRN3突變所致CPP的唯一可靠治療手段。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R725.8
【部分圖文】：

MKRN3 型 Cys-His 識別區(qū)；而以上四種錯義突變分別位于 C3HC4 環(huán)狀鋅指上，第 12 兩個 C3H 鋅指元件之間，C3HC4 環(huán)狀鋅指和第 3 個 C3H 鋅指元件之間，以及蛋白結構域的 C-末端。[見圖 2]

家系病例1-家系圖

圖 3-2：家系病例 1-基因突變測序圖（注：紅色圓圈內即為突變位點的測序峰）系病例 2：臨床特征：患兒（Ⅲ1）為女孩，以乳房發(fā)育為主要臨床表現(xiàn)，乳房開始發(fā)育

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本文編號：2820256