在自然界中,植物生長(zhǎng)常會(huì)受到各種環(huán)境因素的脅迫,例如干旱、水澇、鹽堿和高溫低溫等。這些不良的逆境因子會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝產(chǎn)生一系列影響,嚴(yán)重時(shí)更會(huì)造成植物的死亡。闡明植物抵抗不良環(huán)境因素影響的分子機(jī)制和提高植物的抗逆能力是目前植物研究領(lǐng)域的重要方向。本論文通過(guò)對(duì)模式植物擬南芥的未知功能基因ANK-TM2基因家族進(jìn)行初步功能研究,來(lái)探討這些基因在植物逆境響應(yīng)過(guò)程中的作用。首先從NASC購(gòu)買目的基因T-DNA插入的突變體種子,篩選獲得純合體突變體植株,比較這些突變體在不同逆境脅迫下與野生型擬南芥的表型差異,判斷這些基因在不同植物逆境響應(yīng)中的作用。得到初步結(jié)果后,再應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建候選基因的不同表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥,篩選出純合表達(dá)載體植株,進(jìn)一步深入研究這些基因的功能和作用機(jī)理。目前主要的研究結(jié)果如下:(1)獲得ANK-TM2基因家族中各個(gè)基因的T-DNA純合突變體:根據(jù)ANK-TM2基因家族基因序列信息,從NASC的T-DNA插入突變體庫(kù)中查找相關(guān)基因的T-DNA插入突變體,購(gòu)買相應(yīng)突變體種子,經(jīng)過(guò)多輪PCR鑒定,獲得這些基因的純合突變體植株。(2)ANK-TM2基因家族純合突變體中目標(biāo)基因表達(dá)量與野生型不同:利用熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)目標(biāo)基因在突變體和野生型擬南芥中的表達(dá)量變化,結(jié)果顯示,突變體ank-tm203、ank-tm204中目標(biāo)基因表達(dá)量相比野生型Col-0明顯降低;而ank-tm207、ank-tm208中目標(biāo)基因表達(dá)量相比野生型Col-0明顯升高�？紤]到不同T-DNA插入位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致不同的表達(dá)量變化,我們認(rèn)為這些基因的表達(dá)量都發(fā)生了改變,可以用于下一步逆境響應(yīng)的生理表型研究。(3)ANK-TM2基因家族純合突變體在高鈣、高鹽、干旱等非生物脅迫中有一定的生理表型:對(duì)獲得的純合突變體進(jìn)行干旱、高鹽和低鈣高鈣等處理,通過(guò)觀察它們?cè)诓煌幚硐屡c野生型植株的表型差異,分析比較目標(biāo)基因在植物逆境響應(yīng)中的作用,結(jié)果表明:突變體ank-tm204在0mM CaCl_2條件下根長(zhǎng)比野生型植株短;ank-tm208在0mM CaCl_2條件下,根長(zhǎng)比野生型植株長(zhǎng);ank-tm207在高鈣、高鹽、干旱等條件下均比比野生型植株短。可見(jiàn),ANK-TM204、ANK-TM208和ANK-TM207基因在植物響應(yīng)外界鈣脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫中有可能起到重要的作用。(4)ANK-TM2基因家族純合突變體在生物脅迫中也具有一定生理表型:用PsmES4326注射侵染擬南芥野生型和純合突變體,通過(guò)比較侵染2-3天后葉片中的菌斑量來(lái)判斷擬南芥植株的抗病性強(qiáng)弱,結(jié)果表明:突變體ank-tm202、ank-tm204、ank-tm207和ank-tm208都表現(xiàn)出明顯的抗病性。(5)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了ANK-TM2基因家族的植物表達(dá)載體為進(jìn)一步功能研究做準(zhǔn)備:以pGWB406,pGWB502Ω,pGWB533這三種表達(dá)載體為基礎(chǔ),分別構(gòu)建ANK-TM204、ANK-TM207和ANK-TM208這三個(gè)基因的GFP融合表達(dá)載體,超表達(dá)載體,以及GUS融合表達(dá)載體,以便進(jìn)一步深入研究這些基因的功能和作用機(jī)理。
【學(xué)位單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖1.1植物與病原菌互作模式圖igure1.1Azigzag model illustrates interactions between pathogen and pl南芥ANKTM家族基因概況蛋白（ankyrin）廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，它的主要結(jié)構(gòu)特征是復(fù)序列模體（ankyrin repeat motif，ANK），其作用是把膜蛋白連接白網(wǎng)絡(luò)中，細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞形態(tài)起關(guān)鍵作用。細(xì)胞中的眾多可以將細(xì)胞器連接到細(xì)胞骨架上，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。錨蛋白有重要作用，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA 轉(zhuǎn)錄以及胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)的參與。研究還發(fā)現(xiàn)錨蛋白可能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)李東屏, 2005; Li et al., 2006）。蛋白是一種調(diào)節(jié)蛋白，含有錨蛋白重復(fù)序列的蛋白廣泛存在于各種

圖1.2 ANK重復(fù)序列Figure 1.2 TheANK repeat consensusANK 重復(fù)序列保守性越強(qiáng)，其構(gòu)成的蛋白質(zhì)的功能就越相似（吳,2005）。ANK 重復(fù)結(jié)構(gòu)域主要由 β 片層和 α 螺旋構(gòu)成，并折疊成 β2α2 結(jié)構(gòu)奎等,2008）。整個(gè)結(jié)構(gòu)域像一只彎曲的手，β 片層形成手指，螺旋平面形，手指平面與手掌平面相互垂直，在“手心”內(nèi)部形成了一個(gè)疏水性的深守殘基可能參與每個(gè)獨(dú)立重復(fù)單位的構(gòu)建或形成各重復(fù)單位之間互作的基，對(duì)整個(gè) ANK 結(jié)構(gòu)域起到穩(wěn)定作用。ANK 結(jié)構(gòu)域示意圖如 1.2 所示（Ral., 1998; Li et al., 2006; Kovalchuk et al., 2013）。

圖1.4具有代表性的ANK蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖Figure1.4 Schematic diagram of representative ANK proteins 參與植物自身的防御病原體入侵植物時(shí)，會(huì)被其細(xì)胞表面的受體所識(shí)別，從而激活植物的免抵抗病原菌的侵入。在免疫信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中，錨蛋白作為重要的調(diào)節(jié)到了重要的作用（吳利民和李東屏,2005;Li et al., 2006）。目前已經(jīng)確定反應(yīng)的錨蛋白主要有 At-Phos43、AKP2、ANK1、ACD6 和 NPR1 等（W006; Cristina et al., 2012; Fu et al., 2012; Louis et al., 2012; Kovalchuk e例如：Scott 等從擬南芥中得到了 AtPhos43。當(dāng)植物被病原菌侵入后43 被磷酸化，其 C-末端含有 2 個(gè)錨蛋白單元,可能具有介導(dǎo)蛋白質(zhì)的識(shí)。還有另一類基因，它們調(diào)控表達(dá)的蛋白可以抑制病毒基因的表達(dá)，比性的是 GABPβ，它調(diào)控表達(dá)的蛋白是一類含有 ANK 的蛋白質(zhì)，它的結(jié)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 戴景程;黃建國(guó);王春連;趙開(kāi)軍;;病原菌保守性特征分子及其介導(dǎo)的植物抗病性[J];微生物學(xué)通報(bào);2012年04期

2 盧從明,張其德,匡廷云,王忠,高煜珠;水分脅迫抑制水稻光合作用的機(jī)理[J];作物學(xué)報(bào);1994年05期

本文編號(hào)：2819185