纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成部分,是地球上最豐富的可再生資源,在當(dāng)前世界面臨著能源危機(jī)和環(huán)境壓力的情況下,如何更加有效地發(fā)揮微生物纖維素酶的作用來(lái)分解和轉(zhuǎn)化自然界中儲(chǔ)存巨大的纖維素成為能源物質(zhì),對(duì)解決資源、環(huán)境問(wèn)題以及人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重大的現(xiàn)實(shí)意義,其中定點(diǎn)突變技術(shù)已成為人們改善纖維素酶活性的重要技術(shù)。嗜熱革節(jié)孢是一種嗜熱真菌,能夠產(chǎn)生較強(qiáng)熱穩(wěn)定性和較高活力的酶,是纖維素的分解者之一。本研究意在尋找影響嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶活性的氨基酸位點(diǎn),通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)研究第十二家族糖苷水解酶催化作用機(jī)理,同時(shí)為尋找使酶活性得到提高和酶學(xué)性質(zhì)得到改善的其余氨基酸位點(diǎn)打下基礎(chǔ)。本研究對(duì)來(lái)自嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶基因steg1進(jìn)行克隆,得到的cDNA全長(zhǎng)為711bp,編碼了237個(gè)氨基酸。將目的基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)并純化蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示STEG1蛋白分子量大小為26kDa,與理論值27kDa大小基本一致。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶STEG1三維結(jié)構(gòu)的催化結(jié)構(gòu)域是由18種氨基酸組成的一個(gè)凹槽形狀的活性通道,這十八種氨基酸包括F220、P146、Y145、I144、D72、W137、W37、I147、N35、M135、V74、E133、D116、M171、N168、F118、Y77、W128。通過(guò)對(duì)STEG1結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)纖維素酶在降解纖維素過(guò)程中會(huì)形成不同的結(jié)構(gòu),其中在與多種糖類物質(zhì)反應(yīng)過(guò)程中,位于活性通道上的部分氨基酸位點(diǎn)和葡糖基之間更易形成氫鍵,這些氨基酸位點(diǎn)更易與底物結(jié)合反應(yīng),Y145的-COOH及氨基酸主鏈上的N與葡糖基的-OH之間形成的氫鍵距離都很近。所以本研究合理選擇了位于催化活性通道上的六個(gè)氨基酸位點(diǎn)(N35、W37、Y77、W128、Y145、N168)進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到了八種突變酶(N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q),經(jīng)測(cè)定這八種突變酶的酶學(xué)性質(zhì)各發(fā)生了不同的變化。研究結(jié)果顯示,與原酶WT相比,所有突變酶的活性降低,突變酶Y77F和N35Q的熱穩(wěn)定性得到提高。其中突變酶Y77F、W128S、Y145A的K_m值和k_(cat)值都降低;N35Q的K_m和k_(cat)值都升高;突變酶W37H、Y145F、Y145W、N168Q的K_m值升高,k_(cat)值降低。原酶與突變酶的最適pH為5.0,均保持不變。突變酶Y77F、N35Q的最適溫度降低到50℃,WT和突變酶W37H、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的最適溫度為55℃。研究結(jié)果表明這六種氨基酸在第十二家族糖苷水解酶降解纖維素過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q936;Q78
【部分圖文】：

溶液轉(zhuǎn)移至 HiBind DNA Mini 吸附柱中，一次加入的量 10000rpm 離心 1min。掉廢液，重復(fù)步驟（4），直到所有的樣品都轉(zhuǎn)移至吸附入 300μL 的 Binding Buffer（XP2），在室溫條件下以 1掉廢液，重復(fù)操作（6）。掉廢液，加入 700μL 的 SPW Wash Buffer，在室溫條件下（注意：SPW Wash Buffer 在使用前用 100%的酒精稀釋。掉廢液，重復(fù)操作（8）。3000rpm 空轉(zhuǎn)吸附柱 2min，然后放在超凈操作臺(tái) 2~5min吸附柱放入干凈的 1.5mL 離心管中，加入 15~30μL ddH2O3000rpm 離心 1min，測(cè)濃度。STEG1 酵母工程菌的獲得

嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶的定點(diǎn)突變下分離膠，用染色液染色后用脫色液族糖苷水解酶 STEG1 突變體的真核得基酸序列提交 SWISS-MODEL 得到H12 內(nèi)切葡聚糖酶的晶體結(jié)構(gòu)（PD級(jí)結(jié)構(gòu)的活性通道由 18 種氨基酸（Trp37、Ile147、Asn35、Met135、8、Tyr77、Trp128）組成，本研究選p37、Trp128、Tyr145、Asn168）進(jìn)

族糖苷水解酶 STEG1列分析行提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄得顯示，嗜熱革節(jié)孢第十二家成，從圖 3-1 看中出片段大 WT 基因序列與 GenBank冊(cè)序列為灰腐質(zhì)第十二家族析可得，兩段基因不同之處 C、第 464 位堿基 C、第 60、第 429 位堿基 C、第 51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2818412