發(fā)布時間：2020-09-14 11:04

　　 葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上一種重要的經(jīng)濟水果,制干、鮮食、釀酒、榨汁等多種用途使他給人類社會創(chuàng)造了極高的經(jīng)濟效益,但是廣泛栽植的葡萄品種多為歐洲葡萄,具有極高的感病性,挖掘葡萄抗病基因,分析其抗病的分子機理,對于改善葡萄品種的抗病性具有重要的理論意義和實踐價值。WRKY轉錄因子作為植物特有的轉錄調(diào)節(jié)因子,在植物的抗病調(diào)控過程中具有重要的作用。本研究依據(jù)發(fā)表的葡萄基因組數(shù)據(jù),鑒定了葡萄中存在的WRKY家族基因,并進行了結構、進化和表達分析,初步分析了WRKY家族基因可能參與的生物調(diào)控過程,并以此為基礎克隆了抗病相關的VlWRKY58和VaWRKY10,過表達遺傳轉化模式植物擬南芥及感病的無核白葡萄,驗證了這兩個基因的抗病調(diào)控功能,進而克隆了這兩個基因的啟動子序列,分析了上游調(diào)控元件的激活響應。取得的主要結果如下:(1)依據(jù)發(fā)表的葡萄基因組測序信息,共鑒定得到WRKY基因家族成員59個,根據(jù)他們在葡萄染色體上的位置分布,將其命名為VvWRKY1-VvWRKY59。多重序列比對顯示59個VvWRKY蛋白保守結構域完整,依據(jù)VvWRKY保守結構域特征和系統(tǒng)發(fā)育樹將59個VvWRKY分為了GroupⅠ-Ⅲ三大類,分別包含12、40和6個VvWRKY,GroupⅡ又分成了a-e五個亞組,分別包含3、8、15、7和6個VvWRKY。59個VvWRKY存在4組串聯(lián)重復事件,15組隔離重復事件,并且存在66個和擬南芥AtWRKY之間的同線性事件,說明了重復事件是VvWRKY進化過程中伴隨的一類主要事件。VvWRKY40和VvWRKY45在葡萄根系里表達量較高,VvWRKY42和VvWRKY52在葡萄葉片里表達量較高,這是VvWRKY組織器官特異性表達的體現(xiàn)。22個VvWRKY在葡萄白粉菌處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達,18個VvWRKY在SA處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達,14個VvWRKY在ABA處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達,MeJA和ETH處理后VvWRKY的上調(diào)表達基因數(shù)量更多,干旱脅迫處理后VvWRKY上調(diào)表達也較為明顯,這說明了VvWRKY與葡萄生物脅迫、非生物脅迫及植物激素信號響應確實存在密切的關系,VvWRKY58在白粉菌接種處理后上調(diào)表達明顯,VvWRKY10則在MeJA和ETH處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達。(2)采用RT-PCR從葡萄材料巨峰克隆得到了VlWRKY58的cDNA序列,開放閱讀框為2241 bp,編碼747個氨基酸。構建VlWRKY58 35S誘導的過量表達載體,轉化模式植物擬南芥,轉基因和野生型擬南芥植株接種白粉菌和灰霉菌,發(fā)現(xiàn)VlWRKY58轉基因株系對白粉菌表現(xiàn)出明顯的抗病性,單位質(zhì)量葉片上的孢子數(shù)顯著偏少,而對灰霉菌表現(xiàn)出感病性,病斑面積顯著偏大,而且PR1、NPR1這兩個與SA信號途徑相關的基因在VlWRKY58轉基因擬南芥株系里表現(xiàn)出顯著病原菌誘導表達,而PDF1.2這個與JA信號途徑相關的基因在VlWRKY58轉基因擬南芥株系里病原菌的誘導表達則表現(xiàn)出明顯的減弱,這說明VlWRKY58參與的抗病調(diào)控與SA信號途徑具有一定關系;另外,VlWRKY58轉基因擬南芥株系在接種細菌性病原菌Pst DC3000后表現(xiàn)出明顯的感病性,葉片明顯發(fā)黃,活性菌數(shù)量也顯著偏多,PR1基因在VlWRKY58轉基因擬南芥株系里Pst DC3000的誘導表達呈現(xiàn)下降趨勢,這與接種白粉菌和灰霉菌表現(xiàn)不同。采用反轉錄PCR,從巨峰葡萄克隆得到了VlWRKY58基因-1952bp的啟動子序列,構建了四個啟動子缺失片段載體并瞬時轉化了紅地球葡萄,GUS染色分析,VlWRKY58啟動子-608bp到-1034bp之間的序列存在2.1倍于對照的葡萄白粉菌誘導激活活性,這段啟動子序列分布著兩個TCA-element,一個TGACG-motif,一個P-box和一個TC-rich repeats,可能正是TCA-element的存在,增強了VlWRKY58的SA信號響應,從而增強了VlWRKY58參與的白粉病抗性調(diào)控。通過酵母雙雜交技術篩選得到葡萄葡聚糖1,3-β葡萄糖苷酶、葡萄甘油醛3-磷酸脫氫酶、葡萄寡肽轉運蛋白4等五個不同的葡萄功能蛋白,這些蛋白與VlWRKY58參與的葡萄抗病性調(diào)控可能具有一定的關系。(3)采用RT-PCR從山葡萄‘雙優(yōu)’克隆得到VaWRKY10的cDNA序列,開放閱讀框為954 bp,編碼318個氨基酸。構建了VaWRKY10 35S誘導的過量表達載體,轉化了模式植物擬南芥和無核白葡萄。接種白粉菌、灰霉菌和Pst DC3000后,可以發(fā)現(xiàn)VaWRKY10轉基因擬南芥株系對死體營養(yǎng)型病原菌灰霉菌表現(xiàn)出明顯的抗病性,病斑面積顯著偏小,而對活體營養(yǎng)型病原菌白粉菌及Pst DC3000表現(xiàn)出明顯的感病性,白粉菌單位質(zhì)量葉片上的孢子數(shù)、Pst DC3000單位面積葉片上活性菌的數(shù)量都顯著增多,在接種Pst DC3000后O_2~-含量還顯著降低,VaWRKY10轉基因無核白葡萄接種灰霉菌后發(fā)病狀況也表現(xiàn)出一定程度緩和,另外,LOX3和PDF1.2這兩個與JA信號途徑相關的基因在VaWRKY10轉基因擬南芥株系里灰霉菌的誘導表達表現(xiàn)出顯著提高,這說明VaWRKY10參與的抗病調(diào)控與JA信號途徑可能具有一定關系。后續(xù)同樣采用反轉錄PCR,從‘雙優(yōu)’中克隆得到了VaWRKY10基因-1597bp的啟動子序列,構建了四個啟動子缺失片段載體瞬時轉化了紅地球葡萄,GUS染色分析,VaWRKY10啟動子0到-280bp之間的序列存在4.2倍于對照的MeJA誘導激活活性,這段啟動子序列分布著一個TGACG-motif調(diào)控元件,可能正是該元件參與了VaWRKY10的JA信號響應,從而增強了對灰霉病的抗病性調(diào)控。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.631
【部分圖文】：

（ETI：Effector-triggered immunity）兩種途徑，這兩種途徑的不同之式及免疫應答信號的具體增強過程（Jones and Dangl 2006）。PTI 是別受體（PRRs：Transmembrane pattern recognition receptors）識別類 PAMPs，進而激活下游的免疫調(diào)控反應；ETI 則是植物體內(nèi) R 基蛋白識別病原菌產(chǎn)生的特異的效應因子，進而激活的下游的免疫調(diào)控應成是建立在寄主植物與病原菌在相互作用過程中共同進化過程的基礎原菌會直接或者間接的產(chǎn)生效應因子來產(chǎn)生致病性，利于自身的增殖斷產(chǎn)生 R 蛋白，尤其是 NBS-LRR 類蛋白識別效應因子，使自身抗病原菌的互作進化過程如圖 1-1。

大都含有 C-motif 這個 CaM 結合位點，與鈣調(diào)蛋白的結合對 WRKY 基擬南芥基礎抗病性調(diào)控也具有重要的作用（Chi et al. 2013）；另外，WRKY 轉錄經(jīng)常存在 W-box 轉錄調(diào)控位點，這使得植物體內(nèi)多個 WRKY 轉錄因子之間也經(jīng)相互作用，參與調(diào)控植物的抗病過程，擬南芥 AtWRKY18、AtWRKY40 和 AtWRK個基因的突變，就會導致突變體植株對灰霉菌和 Pst DC3000 抗病性的改變，并變體、雙突變體和三突變體擬南芥植株發(fā)病的表現(xiàn)還存在顯著的差別（Xu e6）。其他物種里也有關于 WRKY 基因參與抗病性研究的報導，棉花中的 GmWRK參與灰霉病的抗性調(diào)控，這個過程與 JA 信號途徑增強，SA 信號途徑減弱存在關iu et al. 2016）；玉米中黃曲病的抗性也與 WRKY 基因參與的植物激素信號調(diào)控有ountain et al. 2015）；白楊 PtrWRKY73 基因的過量表達增強了轉基因擬南芥植株途徑相關基因 PR1, PR2 和 PAD4 的表達，對 Pst DC3000 的抗性增強起到積極的Duan et al. 2015）；大麥中 WRKY 轉錄因子與細菌誘導的系統(tǒng)獲得性免疫抗性調(diào)在一定的關系（Dey et al. 2014）；ZmWRKY79 可以參與玉米體內(nèi)萜類植物抗毒累，對玉米抗病性的產(chǎn)生具有重要作用（Fu et al. 2018）；WRKY group Ⅲ 基因卷葉病毒病也具有一定的抗性調(diào)控響應（Huang et al. 2016）。

圖 2-1 VvWRKY 蛋白的多重序列比對聚類分析 WRKY 蛋白的絕對保守結構，綠色的代表鋅指結構，‘N’和‘C’分別代表 WR的 N 端及 C 端 WRKY 結構。.2-1 Multiple sequence alignment of the WRKY domain among 59 VvWRKY procate the conserved WRKY amino acid domains; green indicate the zinc-finger mots. ‘N’ and ‘C’ indicate the N-terminal and C-terminal WRKY domain of the groupproteins.25

【參考文獻】

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本文編號：2818095