葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)水果,制干、鮮食、釀酒、榨汁等多種用途使他給人類社會創(chuàng)造了極高的經(jīng)濟(jì)效益,但是廣泛栽植的葡萄品種多為歐洲葡萄,具有極高的感病性,挖掘葡萄抗病基因,分析其抗病的分子機(jī)理,對于改善葡萄品種的抗病性具有重要的理論意義和實(shí)踐價值。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在植物的抗病調(diào)控過程中具有重要的作用。本研究依據(jù)發(fā)表的葡萄基因組數(shù)據(jù),鑒定了葡萄中存在的WRKY家族基因,并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)分析,初步分析了WRKY家族基因可能參與的生物調(diào)控過程,并以此為基礎(chǔ)克隆了抗病相關(guān)的VlWRKY58和VaWRKY10,過表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥及感病的無核白葡萄,驗(yàn)證了這兩個基因的抗病調(diào)控功能,進(jìn)而克隆了這兩個基因的啟動子序列,分析了上游調(diào)控元件的激活響應(yīng)。取得的主要結(jié)果如下:(1)依據(jù)發(fā)表的葡萄基因組測序信息,共鑒定得到WRKY基因家族成員59個,根據(jù)他們在葡萄染色體上的位置分布,將其命名為VvWRKY1-VvWRKY59。多重序列比對顯示59個VvWRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域完整,依據(jù)VvWRKY保守結(jié)構(gòu)域特征和系統(tǒng)發(fā)育樹將59個VvWRKY分為了GroupⅠ-Ⅲ三大類,分別包含12、40和6個VvWRKY,GroupⅡ又分成了a-e五個亞組,分別包含3、8、15、7和6個VvWRKY。59個VvWRKY存在4組串聯(lián)重復(fù)事件,15組隔離重復(fù)事件,并且存在66個和擬南芥AtWRKY之間的同線性事件,說明了重復(fù)事件是VvWRKY進(jìn)化過程中伴隨的一類主要事件。VvWRKY40和VvWRKY45在葡萄根系里表達(dá)量較高,VvWRKY42和VvWRKY52在葡萄葉片里表達(dá)量較高,這是VvWRKY組織器官特異性表達(dá)的體現(xiàn)。22個VvWRKY在葡萄白粉菌處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá),18個VvWRKY在SA處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá),14個VvWRKY在ABA處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá),MeJA和ETH處理后VvWRKY的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量更多,干旱脅迫處理后VvWRKY上調(diào)表達(dá)也較為明顯,這說明了VvWRKY與葡萄生物脅迫、非生物脅迫及植物激素信號響應(yīng)確實(shí)存在密切的關(guān)系,VvWRKY58在白粉菌接種處理后上調(diào)表達(dá)明顯,VvWRKY10則在MeJA和ETH處理后表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)。(2)采用RT-PCR從葡萄材料巨峰克隆得到了VlWRKY58的cDNA序列,開放閱讀框?yàn)?241 bp,編碼747個氨基酸。構(gòu)建VlWRKY58 35S誘導(dǎo)的過量表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥植株接種白粉菌和灰霉菌,發(fā)現(xiàn)VlWRKY58轉(zhuǎn)基因株系對白粉菌表現(xiàn)出明顯的抗病性,單位質(zhì)量葉片上的孢子數(shù)顯著偏少,而對灰霉菌表現(xiàn)出感病性,病斑面積顯著偏大,而且PR1、NPR1這兩個與SA信號途徑相關(guān)的基因在VlWRKY58轉(zhuǎn)基因擬南芥株系里表現(xiàn)出顯著病原菌誘導(dǎo)表達(dá),而PDF1.2這個與JA信號途徑相關(guān)的基因在VlWRKY58轉(zhuǎn)基因擬南芥株系里病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)則表現(xiàn)出明顯的減弱,這說明VlWRKY58參與的抗病調(diào)控與SA信號途徑具有一定關(guān)系;另外,VlWRKY58轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在接種細(xì)菌性病原菌Pst DC3000后表現(xiàn)出明顯的感病性,葉片明顯發(fā)黃,活性菌數(shù)量也顯著偏多,PR1基因在VlWRKY58轉(zhuǎn)基因擬南芥株系里Pst DC3000的誘導(dǎo)表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢,這與接種白粉菌和灰霉菌表現(xiàn)不同。采用反轉(zhuǎn)錄PCR,從巨峰葡萄克隆得到了VlWRKY58基因-1952bp的啟動子序列,構(gòu)建了四個啟動子缺失片段載體并瞬時轉(zhuǎn)化了紅地球葡萄,GUS染色分析,VlWRKY58啟動子-608bp到-1034bp之間的序列存在2.1倍于對照的葡萄白粉菌誘導(dǎo)激活活性,這段啟動子序列分布著兩個TCA-element,一個TGACG-motif,一個P-box和一個TC-rich repeats,可能正是TCA-element的存在,增強(qiáng)了VlWRKY58的SA信號響應(yīng),從而增強(qiáng)了VlWRKY58參與的白粉病抗性調(diào)控。通過酵母雙雜交技術(shù)篩選得到葡萄葡聚糖1,3-β葡萄糖苷酶、葡萄甘油醛3-磷酸脫氫酶、葡萄寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4等五個不同的葡萄功能蛋白,這些蛋白與VlWRKY58參與的葡萄抗病性調(diào)控可能具有一定的關(guān)系。(3)采用RT-PCR從山葡萄‘雙優(yōu)’克隆得到VaWRKY10的cDNA序列,開放閱讀框?yàn)?54 bp,編碼318個氨基酸。構(gòu)建了VaWRKY10 35S誘導(dǎo)的過量表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化了模式植物擬南芥和無核白葡萄。接種白粉菌、灰霉菌和Pst DC3000后,可以發(fā)現(xiàn)VaWRKY10轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對死體營養(yǎng)型病原菌灰霉菌表現(xiàn)出明顯的抗病性,病斑面積顯著偏小,而對活體營養(yǎng)型病原菌白粉菌及Pst DC3000表現(xiàn)出明顯的感病性,白粉菌單位質(zhì)量葉片上的孢子數(shù)、Pst DC3000單位面積葉片上活性菌的數(shù)量都顯著增多,在接種Pst DC3000后O_2~-含量還顯著降低,VaWRKY10轉(zhuǎn)基因無核白葡萄接種灰霉菌后發(fā)病狀況也表現(xiàn)出一定程度緩和,另外,LOX3和PDF1.2這兩個與JA信號途徑相關(guān)的基因在VaWRKY10轉(zhuǎn)基因擬南芥株系里灰霉菌的誘導(dǎo)表達(dá)表現(xiàn)出顯著提高,這說明VaWRKY10參與的抗病調(diào)控與JA信號途徑可能具有一定關(guān)系。后續(xù)同樣采用反轉(zhuǎn)錄PCR,從‘雙優(yōu)’中克隆得到了VaWRKY10基因-1597bp的啟動子序列,構(gòu)建了四個啟動子缺失片段載體瞬時轉(zhuǎn)化了紅地球葡萄,GUS染色分析,VaWRKY10啟動子0到-280bp之間的序列存在4.2倍于對照的MeJA誘導(dǎo)激活活性,這段啟動子序列分布著一個TGACG-motif調(diào)控元件,可能正是該元件參與了VaWRKY10的JA信號響應(yīng),從而增強(qiáng)了對灰霉病的抗病性調(diào)控。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.631
【部分圖文】：

（ETI：Effector-triggered immunity）兩種途徑，這兩種途徑的不同之式及免疫應(yīng)答信號的具體增強(qiáng)過程（Jones and Dangl 2006）。PTI 是別受體（PRRs：Transmembrane pattern recognition receptors）識別類 PAMPs，進(jìn)而激活下游的免疫調(diào)控反應(yīng)；ETI 則是植物體內(nèi) R 基蛋白識別病原菌產(chǎn)生的特異的效應(yīng)因子，進(jìn)而激活的下游的免疫調(diào)控應(yīng)成是建立在寄主植物與病原菌在相互作用過程中共同進(jìn)化過程的基礎(chǔ)原菌會直接或者間接的產(chǎn)生效應(yīng)因子來產(chǎn)生致病性，利于自身的增殖斷產(chǎn)生 R 蛋白，尤其是 NBS-LRR 類蛋白識別效應(yīng)因子，使自身抗病原菌的互作進(jìn)化過程如圖 1-1。

大都含有 C-motif 這個 CaM 結(jié)合位點(diǎn)，與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合對 WRKY 基擬南芥基礎(chǔ)抗病性調(diào)控也具有重要的作用（Chi et al. 2013）；另外，WRKY 轉(zhuǎn)錄經(jīng)常存在 W-box 轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)，這使得植物體內(nèi)多個 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子之間也經(jīng)相互作用，參與調(diào)控植物的抗病過程，擬南芥 AtWRKY18、AtWRKY40 和 AtWRK個基因的突變，就會導(dǎo)致突變體植株對灰霉菌和 Pst DC3000 抗病性的改變，并變體、雙突變體和三突變體擬南芥植株發(fā)病的表現(xiàn)還存在顯著的差別（Xu e6）。其他物種里也有關(guān)于 WRKY 基因參與抗病性研究的報(bào)導(dǎo)，棉花中的 GmWRK參與灰霉病的抗性調(diào)控，這個過程與 JA 信號途徑增強(qiáng)，SA 信號途徑減弱存在關(guān)iu et al. 2016）；玉米中黃曲病的抗性也與 WRKY 基因參與的植物激素信號調(diào)控有ountain et al. 2015）；白楊 PtrWRKY73 基因的過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株途徑相關(guān)基因 PR1, PR2 和 PAD4 的表達(dá)，對 Pst DC3000 的抗性增強(qiáng)起到積極的Duan et al. 2015）；大麥中 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性免疫抗性調(diào)在一定的關(guān)系（Dey et al. 2014）；ZmWRKY79 可以參與玉米體內(nèi)萜類植物抗毒累，對玉米抗病性的產(chǎn)生具有重要作用（Fu et al. 2018）；WRKY group Ⅲ 基因卷葉病毒病也具有一定的抗性調(diào)控響應(yīng)（Huang et al. 2016）。

圖 2-1 VvWRKY 蛋白的多重序列比對聚類分析 WRKY 蛋白的絕對保守結(jié)構(gòu)，綠色的代表鋅指結(jié)構(gòu)，‘N’和‘C’分別代表 WR的 N 端及 C 端 WRKY 結(jié)構(gòu)。.2-1 Multiple sequence alignment of the WRKY domain among 59 VvWRKY procate the conserved WRKY amino acid domains; green indicate the zinc-finger mots. ‘N’ and ‘C’ indicate the N-terminal and C-terminal WRKY domain of the groupproteins.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2818095