小麥類過敏反應(yīng)(hypersensitive reaction-like,HRL)是一類在沒有病原物侵染情況下就能自發(fā)產(chǎn)生類似病原菌侵染后的過敏反應(yīng)癥狀,這類突變往往能夠增強(qiáng)小麥的抗病能力并且提高防御相關(guān)基因的組成性表達(dá)。中國小麥品種寧7840通過自發(fā)性類過敏反應(yīng)的產(chǎn)生介導(dǎo)了成株期的廣譜抗病性。EMS誘導(dǎo)獲得了寧7840的兩個HRL缺失突變體:Dlm1和Dlm2,并且兩個突變體都易感白粉病。通過對抽穗期的Dlm1,Dl12突變體和野生型寧7840旗葉提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序來闡述類過敏反應(yīng)產(chǎn)生的分子機(jī)制。結(jié)果表明,在寧7840中,二萜化合物相關(guān)的壓力應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)了類過敏性反應(yīng)和廣譜抗性的產(chǎn)生。此外,在DLM突變體中,氧化磷酸化、蛋白酶解體和光合途徑也與抑制類過敏性反應(yīng)表型相關(guān)。這在小麥中提供了一個新的了解類過敏性反應(yīng)和廣譜抗性的分子機(jī)制的途徑。本實(shí)驗(yàn)對攜帶HRL性狀的寧7840進(jìn)行EMS誘變和連續(xù)選擇,篩選到14個比野生型的HRL表型更為明顯的突變體。同時,對這14個突變體和野生型進(jìn)行四個不同氮素水平處理,結(jié)果表明:寧7840野生型在低氮條件下,能夠誘導(dǎo)HRL性狀的提早表達(dá),隨著施氮量的增加,HRL性狀延遲顯現(xiàn)并逐漸消失(non-HRL),白粉病也隨之加重,表現(xiàn)為氮依賴型;但在高氮(每盆6g和9g尿素)條件下,有2個突變體(NMu-HRL-1和NMu-HRL-2)依舊表現(xiàn)HRL性狀,為非氮依賴型。通過比較13個氮依賴型(包括寧7840野生型)和2個非氮依賴型的HRL突變體氮肥吸收利用情況,發(fā)現(xiàn)兩種類型的突變體的氮肥吸收利用效率和施氮量都成負(fù)相關(guān)關(guān)系,同一氮肥水平下,非氮依賴型突變體穗部的氮含量和氮素吸收利用效率都顯著高于氮依賴型突變體。低氮(每盆Og和3g尿素)條件下,非氮依賴型突變體的葉綠素含量顯著低于氮依賴型突變體,高氮條件下,兩種類型突變體植株內(nèi)葉綠素含量差異不顯著。在同一氮肥處理水平下,這兩種類型的突變體之間白粉病嚴(yán)重度存在極顯著差異,氮依賴型HRL突變體在高氮條件下白粉病嚴(yán)重度極顯著高于非氮依賴型HRL突變體,非氮依賴型突變體在高氮條件下仍然高抗白粉病。小麥品系P7001攜帶的HRL性狀在Og氮處理下表達(dá),但當(dāng)?shù)⿷?yīng)較多時,該性狀消失,因此我們認(rèn)為該表型受氮素調(diào)控,并稱之為氮依賴性。我們結(jié)合BSA和RNA-seq技術(shù)(BSR-Seq),并利用P7001×P216的F5代的重組自交群體將P7001中氮依賴的HRL基因(Ndhrl1)定位在小麥2B染色體的短臂上,位于CAPS/dCAPS標(biāo)記7hrC9和7hr2dc14之間,且HRL性狀與dCAPS標(biāo)記7hrdc2共分離。在此定位的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對小麥2Bs染色體的參考基因組序列的SSR位點(diǎn)篩查,開發(fā)并篩選到207個多態(tài)性SSR標(biāo)記,應(yīng)用其中3個區(qū)間內(nèi)的SSR標(biāo)記和共分離標(biāo)記7hrdc2對F7次級分離群體的2437個單株進(jìn)行基因型分析和表型鑒定,將Ndhrl1定位于分子標(biāo)記7hrdc2與C075783之間,物理距離8.5 Mb。從該基因的染色體位置和性質(zhì)方面來看,Ndhrl1很可能是小麥中的一個新基因。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明,植物-病原體相互作用、氮代謝、玉米素生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)這四條信號路徑在HRL植株和non-HRL植株間差異顯著。該研究對理解小麥HRL性狀的多樣性及解析廣譜抗性機(jī)制以及闡明氮肥、類過敏反應(yīng)和抗病性之間的關(guān)系具有一定的意義。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.12
【部分圖文】：

為了獲取三個樣本間的差異表達(dá)基因，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化分析。差異表達(dá)基因分析表明，逡逑寧７８４０和Ｄ／ｗｉ，寧７８４０和Ｄ／ｍ２還有Ｄ／ｗ／和Ｄ／ｍ２的差異基因表達(dá)的個數(shù)分別為逡逑５５４６，邋３４８９和３９９５個（圖２．２ａ）。其中，在寧７８４０和Ｚ）／ｍｉ／Ｄ／ｍ２中有１７３０條轉(zhuǎn)錄本的逡逑差異基因表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平在和￡＞／？２之間沒有顯著差異，這表寧７８４０逡逑特異的差異基因表達(dá)控制寧７８４０的ＨＲＬ表型。通過同樣的方法也已經(jīng)鑒定出Ｄ／ｍ７中有逡逑２７３５個特異差異基因表達(dá)，并且Ｚ）／ｍ２中有２００個特異的差異基因表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄本的差逡逑異表達(dá)可能是由于Ｄ／ｗｉ和Ｄ／ｍ２中相關(guān)基因的突變（圖２．２ａ）引起的。逡逑為了驗(yàn)證ＲＮＡ－ｓｅｑ的結(jié)果，從ＲＮＡ－Ｓｅｑ數(shù)據(jù)中隨機(jī)挑選２７個不同的轉(zhuǎn)錄本，通過Ｑ－逡逑ＰＣＲ驗(yàn)證兩個對照基因（肌動蛋白和Ｇａｐｄｈ）的表達(dá)水平。為了驗(yàn)證每個引物的特異性，逡逑對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。結(jié)果表明：ＲＮＡ－ｓｅｑ和ｑＲＴＱ－ＰＣＲ技術(shù)的結(jié)果有很高的相關(guān)逡逑

富集（Ｐ＜０．０５）。在細(xì)胞成分中，與葉綠體相關(guān)的器官，如葉綠體基質(zhì)，膜和Ｓｔｒｏｍｕｌｅ顯逡逑著富集。此外，在生物進(jìn)程中，寧７８４０發(fā)生了一系列的變化。在生物和非生物方面如細(xì)逡逑菌，對光，冷和激素的應(yīng)激反應(yīng)都是顯著富集的（Ｐ邋＜０．０５，圖２．３，表２．６）。逡逑表２．６寧７８４０中差異表達(dá)差異基因逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．６邋Ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ＧＯ邋ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ邋ｆｏｒ邋Ｎｉｎｇ７８４０－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ＤＥＧｓ逡逑ＤＥＧ邋數(shù)轉(zhuǎn)ｉ本逡逑}0桃邐目數(shù)目逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：邋Ｎ－ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋（Ｇ０：００１６４１０）邐１２邐３５邐２．２４Ｅ－０５逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：邋ｇａｌａｃｔｉｎｏｌ－ｓｕｃｒｏｓｅ邋ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ逡逑（Ｇ０：００４７２７４）邐’邐＂逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：邋ｓｕｃｒｏｓｅ邋ｌＦ－ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋（Ｇ０：００５０３０６）邐６邐１４邐１．７６Ｅ－０２逡逑

蛋白酶體調(diào)節(jié)顆粒和蛋白酶體核心復(fù)合物，ａ亞基復(fù)合物等五個條目在細(xì)胞成逡逑分中顯著富集。生化合成類別，四個蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)的調(diào)控路徑也表現(xiàn)出顯著差異。此逡逑夕卜，十個與抗病相關(guān)的ｐａｔｈｗａｙ也表現(xiàn)出差異顯著（Ｐ邋＜０．０５，圖２．３，表２．８）逡逑在突變體中，光合作用和氧化磷酸化兩條ｐａｔｈｗａｙ表現(xiàn)出顯著差異（表２．７）。逡逑在分子功能類別中，只有與葉綠素結(jié)合相關(guān)的ｐａｔｈｗａｙ是顯著富集的。葉綠體類囊體膜，逡逑光系統(tǒng)ＩＩ和線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ＡＴＰ合酶復(fù)合物，催化核心Ｆ邋（１）方面，在細(xì)胞組分中顯著逡逑富集。在生化合成類別中，質(zhì)膜ＡＴＰ合成以及質(zhì)子運(yùn)輸和光合電子傳遞鏈路徑表現(xiàn)出顯著逡逑差異（Ｐ邋＜０．０５，圖邋３，表邋２．９）。逡逑表２．７使用ｋｏｂａｓ２．０鑒定的具有代表性的途徑逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．７邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＫＯＢＡＳ２．０逡逑樣品邋ＫＥＧＧ路徑邐ＫＥＧＧ編號本尸澄逡逑寧邋７８４０邐Ｄｉｔｅｉｐｅｎｏｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邐ｋｏ００９０４邐６邐９邐１．５２Ｅ－５逡逑Ｄｌｍｌ邐Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邐ｋｏ０３０５０邐３４邐８６邐２．１１Ｅ－９逡逑Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邐ｋｏ００１９０邐４７邐２０２邐１．５４Ｅ－４逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｉｎ邋ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ邋ｋｏ０４１４１邐４７邐２０３邐１．７９Ｅ－４逡逑Ｄｌｍ２邐Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邐ｋｏ００１

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