核桃為胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)植物,原產(chǎn)我國的栽培種主要有核桃(J.regia)和鐵核桃(J.sigillata)2個種群。核桃堅果品質(zhì)優(yōu)良,與榛子、扁桃、腰果并稱為世界四大干果,核桃作為一種營養(yǎng)密集型保健食品,含有豐富的多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)和次級代謝產(chǎn)物,如多酚類物質(zhì)、生物堿、維生素等,具有抗氧化性、抗菌等一系列藥理功能。課題組前期研究表明蘆丁是鐵核桃膜質(zhì)種皮和葉片中含量最高的單體酚,與鐵核桃總酚、總黃酮含量及抗氧化能力均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,其含量的高低對鐵核桃中總酚含量有重要的影響;利用分子生物學(xué)手段揭示核桃功能成分的合成與調(diào)控機理已成為研究熱點。本實驗以鐵核桃‘黔核7號’葉片為材料,克隆了10個蘆丁合成相關(guān)基因,測定了不同組織間及葉片、果實發(fā)育過程中總酚、總黃酮及蘆丁的含量,分析了相關(guān)酶活性以及基因表達水平,探討了酶活、基因表達與總酚、總黃酮及蘆丁含量間的關(guān)系,為研究鐵核桃蘆丁合成機制提供了更多信息,本研究獲得的主要結(jié)果如下:(1)以鐵核桃‘黔核7號’展葉期葉片cDNA為模板獲得了蘆丁生物合成途徑中的PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、FLS、UGT及GT基因的全長cDNA序列,利用NCBI的Blastp工具進行比對分析顯示,10個結(jié)構(gòu)基因與其它已知植物的相關(guān)基因均具有較高的同源性。運用生物信息學(xué)分析軟件對其蛋白分子量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、信號肽、磷酸化位點、糖基化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等進行了分析,并提交到NCBI的基因庫中,獲得的GenBank登錄號分別為PAL(MG727558)、C4H(MG727559)、4CL(MG736731)、CHS(MG736732)、CHI(MG736733)、F3H(MG736734)、F3’H(MG736735)、FLS(MG736736)、UGT(MG736737)、GT(MG736738)。(2)對5個常用的植物內(nèi)參基因GAPDH、β-Actin、18S rRNA、UBQ和EF-1在核桃(Juglans spp.)中進行了表達分析篩選。其中GAPDH和EF-1在核桃所有樣品中均表達穩(wěn)定,但表達豐度偏低,適合作為表達豐度較低的目標(biāo)基因內(nèi)參;18S rRNA在核桃所有樣品中表達穩(wěn)定性較好,且18S rRNA表達豐度偏高,適合作為分析較高表達豐度目標(biāo)基因時的內(nèi)參;β-Actin和UBQ在核桃樣品中的表達穩(wěn)定性較差,不適合作為核桃中基因表達分析時的內(nèi)參基因。(3)供試的2個鐵核桃品種膜質(zhì)種皮內(nèi)總酚和蘆丁含量顯著高于其他器官,子葉中含量最低;葉片中總黃酮顯著高于其他器官,青皮中含量最低。葉片發(fā)育過程中,2個品種中的總酚含量整體呈上升趨勢;蘆丁含量變化規(guī)律不明顯。青皮中總酚及蘆丁含量呈先降后升再降的變化趨勢。膜質(zhì)種皮中總酚含量呈先升后降再升的變化趨勢;蘆丁整體上升。子葉中總酚含量呈上升趨勢,后期略微下降;蘆丁含量先降后升再降的趨勢。(4)在鐵核桃空間表達研究發(fā)現(xiàn),10個相關(guān)酶活性均具有組織特異性,其中C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、UGT、GT酶活性變化在兩個品種中具有相似性,均在莖中活性最高。10個酶基因的表達也具有組織特異性,其中CHI、F3H在雌花中的表達量最高;F3’H、UGT、GT在膜質(zhì)種皮中的表達量最高;C4H在根中的表達量最高;而PAL在葉片中表達量最低;CHS在莖中表達量最低。兩個品種間基因表達的差異性主要體現(xiàn)在PAL、4CL、CHS、FLS,‘黔核7號’中PAL、4CL、FLS在雄花中的表達量最高;CHS在根中的表達量最高;在‘黔核6號’中PAL在莖中表達量最高;4CL在根中的表達量最高;CHS、FLS在葉片中的表達量最高。(5)鐵核桃葉片發(fā)育過程中,多酚類物質(zhì)含量與相關(guān)酶(除UGT外)活均呈負相關(guān),且與PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、FLS酶活相關(guān)性達到差異顯著水平;與PAL、CHI、F3H、F3’H、UGT基因表達量呈顯著負相關(guān),而與FLS、GT呈顯著正相關(guān)。青皮發(fā)育過程中,多酚類物質(zhì)含量與多數(shù)相關(guān)酶活性呈正相關(guān),與PAL、C4H、4CL、CHI、FLS、UGT、GT達到顯著水平;與PAL、F3H、FLS基因表達量呈顯著負相關(guān),與其他基因的相關(guān)性較弱。膜質(zhì)種皮發(fā)育過程中,多酚類物質(zhì)含量與C4H、CHI、F3’H、FLS、UGT、GT酶活性呈顯著正相關(guān),與4CL酶活呈顯著負相關(guān);與CHS、FLS、GT基因表達量呈顯著正相關(guān)。子葉發(fā)育過程中,多酚類物質(zhì)含量極低,且與相關(guān)酶活的相關(guān)性較弱,僅與CHS基因表達量呈顯著正相關(guān)。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S664.1
【部分圖文】：

究生學(xué)位論文 鐵核桃蘆丁合成相關(guān)基的植物提供思路方法的借鑒。進展其在植物中的分布香苷，是天然的黃酮類化合物。為淡黃色粉末或甲醇；可溶于乙醇、甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯；度在沸甲醇中 0.142 g/mL；沸乙醇中為 0.0167 g/g/mL；其熔點為 176 ~ 178°C，分子式為 C27H30O

圖 2 蘆丁生物合成途徑與涉及到的酶（Zhao et al.,2011）Fig.2 The rutin biosynthesis pathway and the related enzyme(Zhao et al.,2011)由于多種中間化合物的轉(zhuǎn)變存在多條路線，使得整個蘆丁的合成途徑形成了復(fù)雜的網(wǎng)構(gòu)。盡管如此，在轉(zhuǎn)錄組測序廣泛應(yīng)用的過程中已在某些植物中克隆得到該途徑中大多基因全長或其表達序列（Baucher et al., 2003），此外，相關(guān)酶的生理功能及定位均有相關(guān)究及報道。.2.2.1 公共苯丙氨酸途徑涉及酶類及其編碼基因苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase, PAL)是苯丙烷途徑的入口酶和限速酶，連初生代謝和次生代謝，主要催化莽草酸途徑的產(chǎn)物 L-苯丙氨酸脫氨基生成能合成 HCA酸、木質(zhì)素(1ignin)和類黃酮等物質(zhì)的共同底物——反式肉桂酸。Koukol & Conn（1961次在大麥(Hordeum vugare)中發(fā)現(xiàn) PAL 蛋白，隨后 PAL 蛋白被證實廣泛存在于植物、真菌母和藻類中。在研究中發(fā)現(xiàn) PAL 蛋白由一個多基因家族編碼，且不同的家族成員在序列能上都有一定差異(Franke et al., 2000)。PAL 蛋白在番茄(Lycopersicon esculentu )、馬鈴

OD260/OD280 值介于 1.8 ~ 2.1 之間，OD260/OD230 值介于 2.0 ~ 2.3 之間（圖3 右），表明 RNA 無污染，無降解，純度高，滿足后續(xù)實驗的要求。圖 3 核桃樣品 RNA 瓊脂糖電泳圖(左)及吸光比值測定圖(右)Fig.3 RNA agarose gel electrophoresis (left) and light absorption ratio(right) of J. sigillata4.1.2 鐵核桃蘆丁合成相關(guān)基因的 RT-PCR 擴增取 1 μg總 RNA，以反轉(zhuǎn)錄 cDNA 為模板，用基因特異引物分別進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2817446