木薯是世界近8億人口的主糧和重要的工業(yè)原料。朱砂葉螨是木薯四大有害生物之一,藥劑防治很難。培育與利用抗蟲(chóng)品種是最經(jīng)濟(jì)、有效、簡(jiǎn)便的害蟲(chóng)防治途徑,單寧酸是公認(rèn)的具有直接抗蟲(chóng)作用的次生代謝物質(zhì),LAR和ANR是調(diào)控單寧酸含量最關(guān)鍵的兩個(gè)酶,但編碼關(guān)鍵基因MeLAR和MeANR調(diào)控單寧酸含量增強(qiáng)作物抗蟲(chóng)性的功能仍缺乏直接分子證據(jù)。因此,本研究在比較分析朱砂葉螨為害前后抗螨品種C1115和感螨品種BRA900不同葉組織中單寧酸含量、LAR、ANR活性及MeLAR、MeANR表達(dá)水平差異基礎(chǔ)上,系統(tǒng)開(kāi)展MeLAR、MeANR克隆及其抗螨性功能研究。主要研究結(jié)果如下:1.發(fā)現(xiàn)單寧酸含量與木薯抗螨性顯著正相關(guān),初步證明單寧酸在木薯抗螨中的作用及其含量顯著降低是朱砂葉螨趨向于為害木薯中下部葉片的重要原因之一。朱砂葉螨為害抗螨品種C1115未展開(kāi)葉、展開(kāi)幼嫩葉、頂芽下第三葉、中下部葉片單寧酸含量分別較受害前提高超過(guò)2倍,均顯著高于感螨品種BRA900水平。朱砂葉螨為害BRA900后,除了為害8d的中下部葉片單寧酸含量顯著降低外,其它不同部位葉片的單寧酸含量在螨害前后均無(wú)顯著差異。2.發(fā)現(xiàn)LAR和ANR酶活性與木薯抗螨性顯著正相關(guān),初步證明這兩個(gè)酶在木薯抗螨中的作用及其活性顯著降低是朱砂葉螨趨向于為害木薯中下部葉片的重要原因之一。朱砂葉螨為害C1115未展開(kāi)葉、展開(kāi)幼嫩葉、頂芽下第三葉、中下部葉片的LAR和ANR酶分別較受害前提高大約2倍,均顯著高于感螨品種BRA900酶活。朱砂葉螨為害BRA900后,除了為害8d的中下部葉片LAR和ANR酶活性顯著降低外,其它不同發(fā)育階段的葉片LAR和ANR酶活性在螨害前后均無(wú)顯著差異。3.發(fā)現(xiàn)MeLAR和MeANR表達(dá)量與木薯抗螨性顯著正相關(guān),初步證明這兩個(gè)基因在木薯抗螨中的功能,以及其表達(dá)量顯著降低導(dǎo)致LAR、ANR酶活性顯著降低是朱砂葉螨趨向于為害木薯中下部葉片的重要原因之一。朱砂葉螨為害C1115未展開(kāi)葉、展開(kāi)幼嫩葉、頂芽下第三葉、中下部葉片的MeLAR基因表達(dá)量分別較受害前提高大約2倍,均顯著高于BRA900的表達(dá)水平。朱砂葉螨為害BRA900后,除了為害8 d的中下部葉片MeLAR和MeANR表達(dá)量顯著降低外,其它不同部位葉片達(dá)量在螨害前后均無(wú)顯著差異。4.克隆了MeLA 和MeANR基因,獲得具有抗螨功能的轉(zhuǎn)MeLAR和MeANR基因株系,為深度挖掘和創(chuàng)新利用MeLAR和MeANR基因提供理論依據(jù)。室內(nèi)抗螨性結(jié)果表明,朱砂葉螨為害后,轉(zhuǎn)基因株系和C1115的MeLAR和MeANR基因表達(dá)水平、LAR和ANR酶活性、單寧酸含量均顯著提高,朱砂葉螨的Fo代存活率顯著降低,葉片未表現(xiàn)出明顯的螨害癥狀,表現(xiàn)出與抗螨品種C1115相似的抗螨性。而非轉(zhuǎn)基因TMS60444(WT)及BRA900的MeLAR和MeANR表達(dá)水平、LAR和ANR酶活、單寧酸含量分別較為害前顯著降低。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S533
【部分圖文】：

登錄號(hào)邋ＸＰ＿０１５５７４２０８．１）邋；邋ＴＣ：可可（Ｇｅｎｅ邋Ｂａｎｋ邋登錄號(hào)邋ＡＤＤ５１３５３．１）逡逑ＣＳ：邋Ｃａｍｅｌｌｉａ邋ｓｉｎｅｎｓｉｓ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＤＺ５８１６８．１）邋；邋ＤＫ：邋Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ邋ｋａｋｉ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋＮＯ逡逑ＢＡＦ５６６５４．１邋）邋；邋ＶＳ邋Ｖｉｔｉｓ邋ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉｉ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＮＰ＿００１２６７８８５．１邋）邋；邋ＬＣ邋：邋Ｌｏｔｕｓ逡逑ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＢＣ７１３３５．１邋）邋ｊ邋ＭＤ：邋Ｍａｌｕｓ邋ｄｏｍｅｓｔｉｃａ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ逡逑ＮＰ＿００１２８０９３０．１）邋；邋ＭＴ：邋Ｍｅｄｉｃａｇｏ邋ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＡＮ７７７３５．１邋）邋；邋ＰＩＴ：邋Ｐｉｎｕｓ逡逑ｔａｅｄａ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＣＡＩ５６３２１．１邋）邐；邋ＰＨＣ：邋Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ邋ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ逡逑ＣＡＤ９１９０９．１）邋；邋ＧＡ：邋Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ邋ａｒｂｏｒｅｕｎｉ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＮＰ邋００１３１６９３７．１）邋；邋ＰＹＣ：邋Ｐｙｒｕｓ逡逑ｃｏｍｍｕｎｉｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＧＬ８１３５２．１邋）邋；邋ＲＣ邋：邋Ｒｉｃｉｎｕｓ邋ｃｏｍｍｕｎｉｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ逡逑ＸＰ＿０１５５７４２０８．１）邋；邋ＴＣ：邋Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ邋ｃａｃａｏ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＸＰ＿００２５２４４０４．２）逡逑３．５基因表達(dá)載體的構(gòu)建逡逑將己擴(kuò)增得到的ＭｅＵ／？和ＭｄＡＷ基因片段及ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１

３．５基因表達(dá)載體的構(gòu)建逡逑將己擴(kuò)增得到的ＭｅＵ／？和ＭｄＡＷ基因片段及ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１邋（圖２７）用Ｘｂａｌ逡逑和ＢａｍＨＩ雙酶切后分別連接形成新的重組子ｐＣ－３５Ｓ－Ｍｅｉ＾ｉ？（圖２８）和ｐＣ－邋３５Ｓ－逡逑ＭｅＡＷ？（圖邋２９）。進(jìn)一步以重組子邋ｐＣ－３５Ｓ－ＭｅＵ／？和邋ｐＣ－邋３５Ｓ－Ｍ＾Ｍ？質(zhì)粒邋ＤＮＡ邋為逡逑模板，用２．２．８的引物和２．２．５（４）的反應(yīng)體系及程序進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，分別獲得與目的逡逑基因大小一致的基因片段（圖３０

邐木薯單寧酸合成關(guān)鍵基因ＭｅｌＡ？、的克隆及其抗螨性功能研宄邐逡逑ＢａｍＨＩ邐ｘｂａＩ逡逑—｜—：：：丨邋ＨＹＧ邐ＭｅＬＡＲ邐ｕｉｄＡ邐—＇邋—逡逑ＬＢ邐Ｔ邐Ｔ邐Ｔ邐ＲＢ逡逑１邋ｎｏｓ邐１邐ｕｏ＿ｓ邐ｉ邐ｎｏｓ逡逑圖２８二元載體ｐＣ－３５Ｓ－ＭｄＡＲ部分結(jié)構(gòu)圖。ＭＣＳ：多克隆位點(diǎn)；Ｐ３５Ｓ：邋３５Ｓ啟動(dòng)子；逡逑Ｔ３５Ｓ：邋ＣａＭＶ３５Ｓ啟動(dòng)子；ＴＮＯＳ：邋ＣａＭＶ３５Ｓ終止子；ＬＢ和ＲＢ分別指Ｔ－ＤＮＡ左右邊界；逡逑ＨＹＧ：潮霉素抗性基因。逡逑Ｆｉｇ．邋２８邋Ｂｉｎａｒｙ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｐＣ－３５Ｓ－ＭｅＬＡＲ邋ｐａｒｔｉａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ．邋ＭＣＳ：邋Ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｃｌｏｎｉｎｇ逡逑ｓｉｔｅｓ；邋Ｐ３５Ｓ：邋３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ；邋Ｔ３５Ｓ：邋ＣａＭＶ邋３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ；邋Ｔｎｏｓ邋：邋ＣａＭＶ邋３５Ｓ邋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；ＬＢ邋ｌｅｆｔ逡逑ｂｏｒｄｅｒ；邋ＲＢ，ｒｉｇｈｔ邋ｂｏｒｄｅｒ邋ｏｆ邋Ｔ－ＤＮＡ；邋ＨＹＧ：邋ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2808403