目的:肝癌是一種惡性程度較高,治愈率低的臨床常見的惡性腫瘤,居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第四位,病死率的第三位。目前采用包括如手術、放療、化療、分子靶向療法、肝動脈化療栓塞以及中醫(yī)治療等手段治療肝癌,其中化療仍是治療中晚期肝癌的重要手段。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是晚期肝癌化療的主要藥物,但臨床療效仍不樂觀,其失敗的主要原因在于肝癌獲得性耐藥性的產生。因此,深入研究5-FU在肝癌細胞中的耐藥機制具有重要臨床意義。近年來,隨著基因重組技術與分子生物學理論的成熟,有關肝癌耐藥基因的研究不斷涌現(xiàn),這其中化療聯(lián)合基因治療突現(xiàn)出廣闊的應用前景。相關研究報道ATAD2基因與5-FU的化療效果密切相關,而ATAD2基因是一種與腫瘤密切相關的原癌基因,位于染色體8q24.13其表達產物ATAD2又稱ANCCA,在低分化組織或惡性腫瘤組織中高表達,而在分化成熟組織中低表達或不表達。本研究通過利用crispr/cas9基因敲除技術將ATAD2基因敲除,進而觀察肝癌細胞對5-FU的敏感性變化并初步探討其機制作用。研究方法:本研究選用肝癌Huh7細胞和HCCLM3細胞作為研究對象,通過crispr/cas9基因敲除技術將ATAD2基因敲除,建立ATAD2基因沉默的單克隆細胞系即Huh7-sh-ATAD2與HCCLM3-sh-ATAD2。Western blot的方法檢測Huh7-sh-ATAD2細胞和HCCLM3-sh-ATAD2細胞ATAD2的蛋白表達情況。利用CCK-8實驗檢測不同濃度5-FU在48h和72h作用下對Huh7-sh-ATAD2及HCCLM3-sh-ATAD2細胞及其陰性對照細胞增殖抑制作用的差異和特征規(guī)律,并繪制相應的作用曲線。通過流式細胞儀檢測5-FU處理后的細胞進行周期和凋亡的檢測。通過Western blot的方法檢測5-FU處理的癌細胞和未處理的癌細胞中GLi1的蛋白表達情況。結果:1經Western blot技術檢測顯示:敲除ATAD2基因的肝癌Huh7細胞和HCCLM3細胞,ATAD2蛋白不表達,ATAD2基因沉默穩(wěn)定細胞系成建立成功。2 CCK-8增殖實驗表明:1)5-FU作用于Huh7-sh-ATAD2細胞,HCCLM3-sh-ATAD2細胞,Huh-NC細胞以及HCCLM3-NC細胞,隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長,各組細胞增值抑制率逐漸增高。差距具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2)給予5-FU處理,在相同作用濃度及作用時間下,Huh7-sh-ATAD2細胞與Huh-NC,HCCLM3-sh-ATAD2細胞與HCCLM3-NC相比,細胞增殖抑制率顯著增高,差距具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3 Annexin V檢測細胞凋亡,結果顯示:加入5-FU處理后,HCCLM3、Huh-7細胞干擾組的細胞凋亡率均明顯高于對照組,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05),提示沉默ATAD2能夠增強5-FU對HCCLM3、Huh-7細胞的細胞毒性作用。4 PI檢測,加入5-FU處理,干擾組與對照組比較,HCCLM3、Huh-7細胞易阻滯于S期。5經Western blot技術檢測顯示,加入5-FU處理后,基因敲除組的Gli1蛋白表達明顯低于對照組。初步證實ATAD2基因敲除后,5-FU的藥敏性增加可能通過Hedgehog信號通路調控結論:1敲除ATAD2基因后,增加了肝癌細胞Huh7和HCCLM3對5-FU的敏感性。2敲除ATAD2基因后,肝癌細胞對5-FU敏感性增加的機制可能通Hedgehog信號通路調控
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 結果3.1 Western blot 檢測 ATAD2 基因敲除效果運用 crispr/cas9 技術敲除人肝癌細胞 Huh7 和 HCCLM3 的 ATAD2。結果顯示轉染后的細胞較未轉染的細胞 ATAD2 的蛋白表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。表 3.1ATAD2 基因敲除前后灰度值結果Huh7 Huh7-sh-ATAD2 HCCLM3 HCCLM3-sh-ATAD2灰度值 0.51±0.03 0.11±0.03 0.38±0.03 0.068±0.11

.2 不同 5-Fu 濃度下 Huh7 細胞和 HCCLM3 細胞轉染不同時間的細胞Huh7 HCCLM3轉染48h轉染后-48h未轉染-72h轉染后-72h未轉染-48h轉染后-48h未-±0.062 0.819±0.074 0.896±0.021 0.824±0.119 0.936±0.055 0.818±0.076 0.896±0.035 0.779±0.040 0.860±0.011 0.798±0.148 0.873±0.021 0.788±0.040 0.859±0.058 0.712±0.087 0.772±0.019 0.652±0.132 0.782±0.044 0.703±0.099 0.772±0.089 0.555±0.070 0.778±0.031 0.550±0.061 0.748±0.041 0.553±0.073 0.761±0.056 0.447±0.031 0.736±0.050 0.360±0.074 0.729±0.060 0.447±0.017 0.688

不同5-Fu濃度下HCCLM3細胞轉染不同時間的細胞活力

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Mechanism of 5-fluorouracil required resistance in human hepatocellular carcinoma cell line Bel_(7402)[J];World Journal of Gastroenterology;2002年06期

相關博士學位論文 前1條

1 王啟宇;Sonic Hedgehog信號通路活性下調參與人類肝細胞癌中5-FU抑癌作用的研究[D];山東大學;2008年

本文編號：2808359