發(fā)布時間：2020-08-27 18:51

【摘要】：目的:通過體外殺傷實驗確定雙陰T細胞對于髓系腫瘤細胞的殺傷作用,并檢測雙陰T細胞表面NKG2D受體以及白血病細胞表面NKG2D配體的表達,比較不同表達水平細胞的殺傷效率。對于輸注雙陰T細胞后患者的外周血進行定期流式檢測,觀察雙陰T細胞在患者體內的變化。方法:本研究分為兩個部分:一、體外培養(yǎng)及殺傷實驗:從正常人外周血中提取并擴增雙陰T細胞以流式細胞學檢測其純度,培養(yǎng)完成后進行對于凍存的髓系腫瘤原代細胞以及細胞株的殺傷實驗。二、輸注安全性及體內變化:將培養(yǎng)完成的雙陰細胞輸注完成輸注前準備的入組患者體內后,對其血常規(guī)、外周血找異常細胞、生化及生命體征等指標進行定期檢測評估療效以及安全性,同時檢測雙陰細胞及腫瘤細胞在患者外周血中的數(shù)量以及百分比變化。流式細胞學數(shù)據(jù)均采用Flowjo7.6.1軟件作圖并分析。服從正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差方式表示,非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(范圍)表示。連續(xù)性計量資料使用單樣本t檢驗或非參數(shù)檢驗統(tǒng)計分析。使用使用Graph Pad Prism 5及R 3.2.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計圖像及數(shù)據(jù)處理,p0.05時認為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義。結果:一、體外培養(yǎng)及殺傷實驗提取的單個核細胞經過去CD4及CD8處理后再行培養(yǎng),雙陰細胞擴增良好純度可達90%以上,17天時細胞擴增倍數(shù)為483倍。對于細胞株:DNT對于細胞株OCI-AML3的殺傷在效靶比為4:1的時候殺傷效率為30.94±1.25%,對于411細胞株的殺傷則有50.3±1.40%,對于兩種細胞株的殺傷均敏感,與對照組相比均具有統(tǒng)計學差異(p0.05)。對于原代細胞:DNT細胞對6例AML患者的原始細胞殺傷效果強弱不等,在4:1的效靶比狀態(tài)下殺傷效率18.1(4.7-38.7)%雖然高于對照組但不具有統(tǒng)計學意義(p=0.069),隨著效靶比的提高,殺傷效率明顯提高;與對照組相比,效靶比為8:1及16:1的兩組殺傷效率明顯高于對照組(p=0.033,0.00)。二、輸注雙陰T細胞治療安全性評估及該細胞在人體內的變化4例髓細胞白血病患者的8次DNT細胞輸注療程中僅有1例(25%)出現(xiàn)高熱,考慮為發(fā)生了CRS,予以IL-6抗體4mg/kg后患者體溫控制;其中1例輸注后5天出現(xiàn)散在紅色皮疹,血常規(guī)可見嗜酸性粒細胞增高,考慮為過敏反應,予以西替利嗪抗過敏治療后癥狀消失;4例患者均沒有發(fā)生a GVHD或c GVHD,也未發(fā)生肝腎功能損害或出現(xiàn)中樞神經癥狀,免疫球蛋白正常,輸注過程順利,未出現(xiàn)寒戰(zhàn)、呼吸窘迫、心動過速等癥狀,僅1人出現(xiàn)輕微煩躁癥狀;輸注后2-3周中性粒細胞及血小板、血紅蛋白均恢復治療前水平,造血功能無明顯損害。DNT細胞輸注患者體內后6h在外周血中檢出比例極低,48h后DNT細胞數(shù)量開始增加,輸注5天后數(shù)量增加速度迅速加快;第二次輸注后細胞數(shù)量持續(xù)增加,第5天數(shù)量稍有下降,第7天再次開始迅速增加,而后在28天內維持一定水平。輸注后外周血DNT細胞絕對值的增長在具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4例患者中有3例為血液學復發(fā),在第一次輸注DNT細胞后,原始細胞比例均獲得了不同程度的下降;長期隨訪顯示原發(fā)病復發(fā)經DNT細胞治療后,4例患者中3例患者于DNT治療后2月、6月、10月死于原發(fā)病,1例患者治療至今5個月依然生存。結論:1.對于來自健康人并已使用抗體吸附法去除CD4/CD8陽性T細胞的外周血單個核細胞,使用加拿大多倫多大學Zhang L教授的專利技術(名稱:擴增雙陰性T國際專利號:PCT/CA2006/001870、US9,018,004;中國專利號:200680043116.7)進行培養(yǎng)切實可行,擴增效果良好,純度極高;培養(yǎng)完成的DNT細胞對于髓系腫瘤細胞株的殺傷作用極為明顯;DNT細胞對于AML患者的原始細胞殺傷效率存在差異,但總體效果良好,具有統(tǒng)計學意義;初步推測DNT細胞可能通過NKG2D、DNAM-1與白血病細胞表面相應的配體結合發(fā)揮殺傷作用。2.DNT細胞輸注人體治療髓系腫瘤是安全的,其沒有明顯的脫靶損害正常細胞組織現(xiàn)象,CRS發(fā)生率低,無明顯相關并發(fā)癥發(fā)生;其進入人體后可在體內繼續(xù)增殖,在輸注28天內維持一定水平;DNT細胞治療對于髓系腫瘤的治療還需要通過進一步研究篩選合適患者以及增加治療劑量以提高療效。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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本文編號：2806482