【摘要】：花生果腐病是花生生產(chǎn)上的一種主要病害,對花生的產(chǎn)量和品質構成了嚴重的威脅。近年來此病在我國北方產(chǎn)區(qū)有連年加重之勢。目前對花生果腐病的研究主要集中于對已知病原菌的分類和鑒定上,對于近幾年果腐病多發(fā)的山東萊西地區(qū)的致病真菌的分離與鑒定卻少有報道,有關花生響應果腐病的機理研究也鮮有報道。本研究以花生果腐病根際土壤和感病花生為材料,利用454 FLX+測序技術分離了萊西地區(qū)果腐病病原真菌;以感病前后的花生籽仁為樣品,利用轉錄組和miRNA測序技術構建了花生響應果腐病相關基因和miRNA的表達變化圖譜,并且篩選了關鍵基因AhMAKK4進行基因克隆和抗性分析等研究。通過這些研究,可以有目的性的分離病原真菌,克隆花生響應果腐病過程的關鍵基因及miRNA,為利用基因工程改良花生抗病性提供病原材料和理論基礎。本研究取得主要結果如下:(1)利用454 FLX+測序技術分離了萊西地區(qū)花生果腐病土壤中的病原真菌。測序得到真菌ITS序列46,723條,注釋得到1,706個OTUs(Operational Taxonomic Units),其中對照樣品OTUs共計1206個,果腐病樣品中OTUs共計974個,對照樣品和果腐病樣品中共有的OTUs數(shù)量是474個。真菌OTUs可以分類到6個門,24個綱,272個屬。分類到種的水平上,物種豐度最高的真菌是Fusarium sp.OreYA。RDA(Redundancy analysis)分析發(fā)現(xiàn)花生品種、環(huán)境因子和病原真菌之間存在密切的相關性。這些分析表明,花生感染果腐病之后土壤真菌數(shù)量下降,而且其結構變化趨勢受到土壤環(huán)境因子和花生品種的共同影響,且在萊西地區(qū)果腐病病原真菌以鐮孢菌為主。從花生果腐病土壤中分離出4種未知真菌,從感病花生上分離到1種鐮孢菌�；ㄉ酌绾碗x體組織接種該鐮孢菌發(fā)現(xiàn),幼苗活體和離體組織均被其侵染并發(fā)病,這表明該鐮孢菌可能是花生果腐病的致病真菌。(2)利用轉錄組測序得到花生響應果腐病相關的基因表達變化圖譜。轉錄組測序共計得到Unigene 60,756個,其中差異表達基因共計14,482個,表達量上調的基因10,147,下調的基因4,334個。qRT-PCR檢測了21個基因的表達變化趨勢,其結果和轉錄組測序結果一致。GO富集分析差異表達基因被分類到24種細胞組分,5種分子功能和23種生物過程中。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析發(fā)現(xiàn)有4,291個差異基因被注釋到34條代謝通路中,其中70個差異表達基因參與多種植物激素信號轉導途徑,50個差異表達基因參與植物-病原菌互作途徑,17個差異表達基因參與MAPK信號轉導途徑。這些分析表明在花生響應果腐病過程中存在大量差異表達基因,推測其抗病過程是多基因共同作用的結果。(3)篩選得到花生響應果腐病相關的激素信號轉導途徑和關鍵基因。在水楊酸介導的抗病途徑中,2個NPR1基因在果腐病樣品中表達量下調;5個TGA基因在果腐病樣品中表達量下調,而PR基因在兩樣品中表達量沒有明顯變化。在茉莉酸介導的抗病途徑中,2個JAR1基因在對照樣品中表達量上調,而JAZ在果腐病樣品中表達量下調。在乙烯介導的抗病途徑中,1個ETR基因在對照樣品中表達量上調,而2個EIN3和1個EBF1-2基因在對照樣品中表達量下調。這說明果腐病病原菌入侵花生時,可能是茉莉酸的含量上升降解了JAZ促使下游的轉錄因子EIN3和EBF1-2等的表達起始轉錄。在生長素介導的信號途徑中,3個GH3基因在果腐病樣品中表達量上調,6個IAA基因在對照樣品中表達量上調。這說明花生響應果腐病與內源激素變化有很大關系,通過分析關鍵基因的表達變化圖譜,推測花生可能通過JA/ET介導的抗病途徑來抵抗果腐病病原菌的侵染。(4)利用小RNA測序分析得到花生響應果腐病過程中miRNAs的表達變化圖譜。miRNA測序共獲得了334個miRNAs,其中有97個miRNAs在果腐病脅迫后表達量下調,27個miRNAs在果腐病脅迫后表達量上調。qRT-PCR檢測了15條miRNA的表達趨勢,絕大多數(shù)的miRNA表達趨勢與sRNA測序結果一致,這表明miRNA測序結果的準確性較高。對mi RNAs做靶基因預測,有303個miRNAs預測到1,998個靶基因和2,646個靶標位點。119個差異表達miRNA預測到152個靶基因。這說明,在花生響應果腐病的過程中產(chǎn)生不同的miRNA,其表達趨勢也不同,而且同一個miRNA可以靶標多個基因,可能存在多個靶標位點。(5)轉錄組和miRNA測序的關聯(lián)分析。結果發(fā)現(xiàn)受10個miRNA所調控的14個基因在轉錄組測序結果中均可以檢測到。同時還檢測到4個miRNA和其靶基因間存在負調控關系。這說明miRNA通過負調控靶基因參與花生響應果腐病的分子調控過程。(6)篩選出抗病關鍵基因AhMKK4,進行基因克隆和表達分析研究�？寺〉玫紸hMKK4基因,其序列全長1,434bp,含有3'非編碼區(qū)151bp,5'非編碼區(qū)317bp,開放閱讀框全長966bp,編碼一條含有322個氨基酸的蛋白序列。預測其分子量為36.74kDa,屬于MAPKK基因家族D組成員。亞細胞定位顯示AhMKK4基因定位于細胞質和細胞核中。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在根中表達量高于其他組織,具有組織表達特異性,受JA誘導時表達量上調,受SA誘導時表達量下調。這結果推測該基因可能在花生根中參與到JA介導的抗病過程。(7)花生AhMKK4基因的轉基因功能研究。將AhMKK4構建在正義植物表達載體上,轉入擬南芥,經(jīng)篩選驗證后,獲得AhMKK4超表達轉基因擬南芥。繼代培養(yǎng)轉基因擬南芥到T_2,進行非生物脅迫下的抗性分析。獲得轉基因擬南芥,在非生物脅迫下的抗性分析發(fā)現(xiàn),轉基因植株不具備鹽、滲透等抗性,在ABA、JA、IAA脅迫條件下,根生長受到抑制。這將為下一步花生中基因功能驗證提供理論基礎。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S435.652
【圖文】：

在果腐病 3 個樣品中共有的 OTUs 共計 89 個；而 1L 和 2L 都；2L 和 3L 都含有的 OTUs 共有 130 個，1L 和 3L 都含有的 O果表明，花生感染果腐病之后土壤中真菌數(shù)量下降，而且在不真菌的變化也有所不同。中的 OTUs 覆蓋度在 97%到 99%之間，樣品稀釋曲線分析顯 6,000 個時達到峰值（圖 2-2），測序飽和度很高，數(shù)據(jù)可靠。每個土壤樣品的真菌組成都很豐富，均勻程度很高。進一步對樣性分析：群落豐富度指數(shù) Chao1（59.82-72.84%）和 ACE（4樣品的物種群落豐富度不同；群落多樣性指數(shù) Shannon 和 Simp的土壤樣品中，物種多樣性明顯降低，而且在花生品種 2 中，最高，而果腐病樣品物種群落豐富度最低（表 2-2）。這些結果物種群落豐富度差異。

圖 2-2 6 個土壤樣品的稀釋曲線顯示測序強度與 OTUs 的數(shù)量關系分析C：是對照樣品，L：是果腐病樣品；1、2、3：3 個花生品種。arefaction curves showing the relationship between sampling intensity and the number of recovered opertaxonomic units (OTUs) from soil of a peanut pod rot field at harvest timeC: the control sample; L: the pod rot sample. 1, 2, 3: the three cultivars.表 2-2 樣品 454 FLX+測序的序列信息及 OTUs 的豐度及多樣性分析 Information of sequences obtained and OTUs richness and diversity index for 454 FLX+ pyrosequencingsoil samplesOTU，操作分類單元；a 利用 mothur 軟件，基于標準化的序列的 3%遺傳水平進行計算。1C 1L 2C 2L 3C 3LNo.ofhighqualitysequences8992 8800 8504 6525 7575 6327OTUscoverage（%）99 98 97 97 97 97ObservedOTUsa506 297 649 478 585 505Chao1766 425 891 799 847 805ACE869 497 889 1008 987 909Shannona4 3.85 5.05 3.58 4.53 4.48Simpsona0.08 0.05 0.02 0.11 0.04 0.03

山東農(nóng)業(yè)大學博士學位論文（Zygomycota），約占總序列數(shù)的 3.34%；525 個 OTUs 并沒有分類到任未知真菌序列，約占總序列數(shù)的 30.77%。另外，16 個 OTUs 分類到寄他動物身上的后鞭毛真核生物（Ichtyosporea）；剩余的95個OTUs在Ge同源序列。菌類群在花生的 3 個品種的 6 個樣品中分類和數(shù)量明顯不同。將每個樣繪制成柱狀圖，如圖 2-3 所示：與對照樣品相比，子囊菌門和擔子菌門，而未知真菌的數(shù)量顯著下降；在品種 2 中，相比對照，果腐病土壤樣量明顯下降；接合菌門的數(shù)量在果腐病樣品 1 中上升，而在果腐病樣品在 NCBI 上沒有同源序列的 95 個 OTUs 數(shù)量在果腐病樣品 1 和 3 中上升品 2 中明顯下降。這些結果表明，真菌組成結構存在很大的樣品間差異

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