【摘要】：生物鐘是一種細胞內(nèi)源的時間控制系統(tǒng),它能夠幫助生命體“預測”周圍自然環(huán)境條件在24h內(nèi)的周期性變化,并使生命體“提前”對環(huán)境因子的晝夜變化做出恰當而適時的響應。在植物基因組中,大部分抗逆基因均受到內(nèi)源生物鐘的精細調(diào)控。當植物體處于正常生長狀態(tài)時,內(nèi)源生物鐘會控制大部分脅迫應答基因的表達狀態(tài),并使這些脅迫應答基因的整體表達模式表現(xiàn)出與基礎代謝活動相協(xié)調(diào)的晝夜節(jié)律性。與之相對應的是,當主要環(huán)境因子發(fā)生偶然的或處于植物正常生理耐受范圍內(nèi)的輕微改變時,植物內(nèi)源生物鐘系統(tǒng)會通過自身補償反應保持生物鐘系統(tǒng)和植物逆境脅迫耐受系統(tǒng)的運行穩(wěn)定,從而保證植物體不會對偶發(fā)和細微環(huán)境變化產(chǎn)生過激的應答反應;而超出生理范圍的環(huán)境脅迫不僅會顯著改變植物生物鐘基因的表達模式,而且還會引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差異剪接,最終使得原本受生物鐘控制的下游代謝途徑發(fā)生脅迫應激性的反應,并開啟相關(guān)的信號傳導通路來應對脅迫。禾本科大麥屬作物-青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum hook.f.)又稱“裸大麥”,是我國青藏高原地區(qū)居民栽培的最主要糧食作物。青藏高原地區(qū)被認為是現(xiàn)代主要栽培大麥品種的起源地,而青稞則是唯一能夠真正適應被稱之為“世界屋脊”的青藏高原地區(qū)極端氣候的大麥屬作物,在當?shù)匾呀?jīng)有了上千年的人工栽培史。研究者們通常認為,青稞在長期適應低溫、缺氧和強紫外輻射的高原生境的過程中,進化出了較強的內(nèi)源抗逆性系統(tǒng),并在其基因組中積累了豐富的抗逆基因遺傳資源。因為青稞固有的這種生理和遺傳特性,使其成為一種很好的研究禾本科植物非生物和生物脅迫耐受性的模式植物。受困于青稞轉(zhuǎn)基因?qū)嶒烍w系的不完善,利用青稞突變系研究基因的功能,并分析基因調(diào)控的信號通路目前仍然是一項極具挑戰(zhàn)性的任務。值得注意的是,近幾年隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和普及,青稞及其近緣種栽培大麥都已完成了基因組測序,也實施了某些特定實驗條件下的RNA seq轉(zhuǎn)錄組測序研究。這些都為采用基因組學手段研究青稞的抗逆性分子機制提供了有力的條件。本論文的主要研究目的是:在變溫條件下,對青稞生物鐘基因和常見非生物脅迫抗性基因的表達模式進行檢測和分析,進而研究環(huán)境低溫對植物生物鐘基因表達節(jié)律性和抗逆性基因應激表達調(diào)控模式的影響,為研究生物鐘調(diào)控抗逆基因表達的機理打下實驗基礎。本論文的主要研究內(nèi)容如下:1.在非生物脅迫條件下,適用于青稞時序樣本熒光實時定量RT-PCR(q RT-PCR)實驗的內(nèi)參基因篩選根據(jù)相關(guān)文獻報道,實驗工作首先選擇了禾本科相關(guān)研究報道中常用的actin、e2、α-tubulin、β-tubulin、gapdh、hsp90、ef-1α、samdc、pkaba1、pgk等10個管家基因,作為進行后續(xù)目標基因表達分析時內(nèi)參基因的候選者。接著利用q RT-PCR實驗對上述基因在不同脅迫處理條件下的相對表達量進行了測定。然后使用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper等3種通用軟件包對q RT-PCR實驗中獲得的各候選內(nèi)參基因相對表達量數(shù)據(jù)進行表達穩(wěn)定性分析。研究結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,hsp90和tubα是最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。而在干旱和低溫脅迫條件下,最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因分別是act、e2和tubα、ef-1α。最終使用植物核心生物鐘基因cca1作為靶基因,對上述基于數(shù)學統(tǒng)計獲得的內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估結(jié)果進行驗證。結(jié)果證實,通過綜合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper等3個軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),篩選得到的最適內(nèi)參基因均能很好地適用于應用q RT-PCR方法分析目標靶基因節(jié)律性表達的相關(guān)研究。2.青稞生物鐘基因和抗逆性相關(guān)基因靶序列的選擇以及節(jié)律性表達模式分析根據(jù)擬南芥、水稻、小麥和大麥等植物中已經(jīng)報道的生物鐘相關(guān)基因(cca1、toc1、lux、elf3、gi、co1、co2、ft1等)序列,以及應答非生物脅迫響應的抗逆性關(guān)鍵基因(cbf4、nhx1、nhx2、nhx3、cbl2、cbl4、cbl6、cbl8、p5cs、p5cr、cat1、cat2等)的序列,應用Blast在線檢索工具,在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中,檢索獲得大麥(青稞近緣種)核酸數(shù)據(jù)庫中與上述目標基因的同源m RNA序列或c DNA文庫EST序列作為本實驗中下一步進行節(jié)律性表達分析的目標靶序列。獲得上述目標靶基因序列后,運用Primer Premier 5.0軟件和DNASTAR軟件包中的Primerselect模塊設計適用于后續(xù)q RT-PCR實驗要求的引物。并利用半定量PCR對引物的有效性進行驗證。研究結(jié)果表明,在25℃正常栽培溫度條件下的青稞葉片組織內(nèi),生物鐘基因(如,cca1、toc1、lux、elf3、gi、co1、co2、ft1)和部分抗逆相關(guān)基因(如,cbf4、cbl2、cbl4、cbl8、p5cs、p5cr、cat2、nhx1、cmo1、m6pr、sod1、lea3、cmo1、m6pr、sod1 and lea3等)的表達均表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性表型。當環(huán)境溫度降低到15℃,大部分的上述節(jié)律性表達的基因仍然保持了其在正常生長溫度下的表達模式。而在溫度繼續(xù)降低到5℃時,原本在常溫下呈現(xiàn)顯著節(jié)律性的相關(guān)基因均不同程度失去或減弱了其節(jié)律性表達模式。其中,生物鐘相關(guān)基因的節(jié)律性表型均被低溫環(huán)境打破,而且其在表達峰值時刻的轉(zhuǎn)錄水平受到低溫環(huán)境的顯著抑制。大部分抗逆性相關(guān)基因的時序表達模式及相對豐度也不同程度的受到低溫環(huán)境的不利影響。有趣的是,研究中發(fā)現(xiàn)青稞cbl4基因的節(jié)律性表達模式似乎在短時內(nèi)不受驟然低溫環(huán)境的影響,但是在長時低溫處理條件下,該基因的節(jié)律性表達也趨于喪失。3.在突然施加的低溫脅迫條件下,維持節(jié)律性表達模式的抗逆性基因Hvcbl4的分子克隆及原核表達根據(jù)突然施加的低溫脅迫處理不會阻礙青稞Hvcbl4基因在短時的節(jié)律性表達模式這一研究結(jié)果,研究者推測青稞Hvcbl4基因在驟然低溫處理下的節(jié)律性調(diào)控受到了來自cca1/lhy-toc1反饋環(huán)路之外的其他時間線索的影響。為了進一步對該基因的功能進行深入的研究,我們應用RT-PCR方法從青稞中克隆了Hvcbl4基因,并成功構(gòu)建了攜帶該基因的原核表達載體p MAL-c2X-Hvcbl4,進而將其轉(zhuǎn)化至表達宿主菌TB1進行誘導表達。誘導表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證明,該基因在大腸桿菌中能夠以融合蛋白MBP-Hv CBL4的形式成功誘導表達。之后,我們將嘗試純化MBP-Hv CBL4融合蛋白,用于制備Hv CBL4蛋白的特異性抗體,為后續(xù)Hv CBL4蛋白功能驗證工作積累實驗基礎。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S512.3
【圖文】：

圖2-1內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析的基本思路re 2-1 The technology roadmap for the stability analyzing of reference gene expr1 候選內(nèi)參基因的選擇及引物設計據(jù)前人的研究報道，通過在線工具 Blast 從 National Institutes of He 數(shù)據(jù)庫選擇來自大麥（Hordeum vulgare）的十個已知的管家基因作因。這些基因包括是 act（GenBank：AY145451.1）、e2（AY220735）0042.1）、tubβ6（AM502854.1）、gapdh（AK359500.1）、ef-1α（JN10753（AK368996.1）、pkaba1（AB058924.1）、pgk（AK251528.1）和325266.1）。然后根據(jù)這些基因的 mRNA 序列，用 Primer Premie（r版本計用于 qRT-PCR 擴增的引物，并由生工生物工程（上海）股份有2 植物材料處理及時序（time course）樣本的收集

西北大學碩士學位論文50μE M 2 s 1，12L/12D 光暗交替照明條件下無菌萌發(fā) 10 天。當青稞苗長至 10c左右時，在給予光照開始的同時給予脅迫處理 24h（其中，低溫脅迫為 5°C 處理；鹽脅迫為 300mM NaCl；干旱脅迫為 15％（w/v）PEG6000）。然后在脅迫處理第2 天，給予光照開始的同時開始每隔 4h 取 0.1g 葉片作為樣品，連續(xù)取 1 天。所取樣品立即放入液氮中，并凍存在-80°C 冰箱直到 RNA 的提取。2.1.4.3 樣品總 RNA 的提取以及 cDNA 的合成2.1.4.3.1Trizol 法提取 time course 樣本的總 RNA利用改進的 Trizol 法，從 0.1g 冷凍葉樣品中提取總 RNA。步驟如圖 2-2 所示：

Table 2-5 The contents of RT-PCR reaction systemRT-PCR 反應程序如下：圖2-3 RT-PCR 反應程序Figure 2-3 Reaction procedure of RT-PCR實時熒光定量 PCR 反應體系如下：Components The amount of reagentPremix Taq 10μLPrimer 1 0.2μLPrimer 2 0.2μLddH2O 8.6μLcDNA 1.0μLTotal 20.0μL

【參考文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 來盼;藍藻prx基因抗氧化功能及其與Kai生物種關(guān)聯(lián)關(guān)系研究[D];西北大學;2016年

本文編號：2803485