【摘要】：干旱脅迫是危害重要糧食作物水稻(Oryza sativa)正常生長(zhǎng),影響產(chǎn)量的逆境之一。植物受到干旱逆境脅迫時(shí),會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)NH4+的積累,過(guò)量NH4+對(duì)細(xì)胞有毒害作用。在植物中NH4+同化途徑有兩條,即谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)/谷氨酸合成酶(glutamate synthase,GOGAT)途徑和谷氨酸脫氫酶(glutamatedehydrogenase,GDH)途徑。然而,植物體內(nèi)的GDH對(duì)NH4+的親和能力較低,使GDH對(duì)NH4+的同化作用不能有效的進(jìn)行。因此,提高植物中GDH對(duì)NH4+的同化能力,降低干旱脅迫引起細(xì)胞內(nèi)高濃度的NH4+的毒害作用,是抵抗干旱脅迫的有效途徑�；谝酝难芯�,對(duì)EcGDH,一個(gè)從真菌謝瓦散囊菌(Eurotium chevalier)中克隆得到GDH基因,并將其轉(zhuǎn)入水稻(Oyza sativa cv.Kitaake)中過(guò)表達(dá),并對(duì)其影響水稻耐旱機(jī)理進(jìn)行相關(guān)研究。1.通過(guò)原核表達(dá)重組蛋白,對(duì)純化之后的EcGDH蛋白進(jìn)行體外酶活的測(cè)定,也分析了轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)的GDH酶活。發(fā)現(xiàn)His-TF-EcGDH在體外氨化酶活高于脫氨化酶活性,NADP(H)-GDH在轉(zhuǎn)基因株系中的酶活顯著高于野生型,且氨化的酶活性也顯然要比去氨化酶活性高。2.分析轉(zhuǎn)基因株系Ubi::EcGDH-12和Ubi::EcGDH-13在正常和模擬干旱脅迫下的表型,并觀察葉片氣孔形態(tài),在模擬干旱脅迫處理?xiàng)l件下,過(guò)表達(dá)EcGDH轉(zhuǎn)基因株系的抗干旱能力明顯高于野生型植株,轉(zhuǎn)基因株系的全開(kāi)氣孔的比例顯著低于野生型。3.測(cè)定了正常和模擬干旱下NH4+、谷氨酸、脯氨酸及可溶性糖的含量,通過(guò)定量PCR分析了EcGDH基因?qū)Ω彼徇\(yùn)輸和水稻逆境響應(yīng)相關(guān)基因在正常條件下和在脫水處理?xiàng)l件下mRNA表達(dá)水平的影響。在模擬干旱處理下,轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系相比,NH4+含量要低,而谷氨酸、脯氨酸以及可溶性糖的含量顯著高于野生型。qR-PCR結(jié)果顯示,在模擬干旱處理下,轉(zhuǎn)基因株系中與脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)以及干旱誘導(dǎo)表達(dá)的基因的表達(dá)量也明顯高于野生型。4.由于干旱脅迫總伴隨著氧化損傷,為了驗(yàn)證EcGDH基因的過(guò)表達(dá)是否能提高水稻的抗氧化能力,分析了 CAT、POD、SOD和MDA一系列氧化相關(guān)指標(biāo)。研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系中的CAT、POD、SOD在模擬干旱條件下含量高于野生型,MDA的含量處理?xiàng)l件下則低于野生型。由此表明,水稻中異源表達(dá)謝瓦散囊菌EcGDH能夠通過(guò)提高GDH酶活,將由脅迫引起的過(guò)量積累的NH4+生成谷氨酸,降低高NH4+引起的細(xì)胞毒害,從而提高EcGDH過(guò)表達(dá)株系水稻對(duì)干旱的耐受性,為尋找抗旱新品種水稻奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S511
【圖文】：

增強(qiáng)［５５－５火在苜蓿和小麥中轉(zhuǎn)入微生物的毋仇４基因，能明顯提高它們的除草劑抗逡逑性，說(shuō)明ＧＤＨ與植物抗逆的能力相關(guān)網(wǎng)。ＧＤＨ能夠?qū)ⅲ玻希呛停危龋矗a(chǎn)谷逡逑氨酸，因此在植物碳和氮的代謝循環(huán)中具有重要意義，其體的生理作用仍然很大逡逑探索空間［６１－６３］。ＧＤＨ可以分解碳源，可以在碳含量缺乏的時(shí)候?yàn)槿人嵫h(huán)提供逡逑碳骨架，來(lái)維持植物細(xì)胞內(nèi)碳氮的平衡［６４？？。細(xì)胞內(nèi)氨的積累受外界氨的含量影逡逑響，也可能源于衰老誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解或者非生物脅迫，并能因此而提高ＧＤＨ逡逑的氨化活性［６９＿７５］。在長(zhǎng)于植物莖底部、發(fā)育完全和生理代謝活躍的葉子中，逡逑ＧＯＧＡＴ的表達(dá)量很高，且它有大的蛋白質(zhì)積累量和很強(qiáng)的蛋白活性，而ＧＤＨ的逡逑量和活性則很低。但在植物生長(zhǎng)發(fā)育的后期，隨著ｇ＜＾－ＮＡＤ基因的表達(dá)，ＧＤＨ逡逑蛋白會(huì)隨之積累并且氨化酶活性也會(huì)增加，而ＧＳ和ＧＯＧＡＴ在衰老的葉片中會(huì)逐逡逑漸減少逡逑１．３．２邋ＧＤＨ與植物干旱逆境逡逑ＧＤＨ與脯氨酸的合成有著緊密的關(guān)聯(lián)。當(dāng)植物處于干旱脅迫下時(shí)能進(jìn)行自我逡逑調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞膨壓進(jìn)行維持，防止脫水死亡，稱(chēng)為滲透調(diào)節(jié)（Ｏｓｍｏｔｉｃ邋Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ，逡逑

工程碩士學(xué)位論文逡逑量移液器：德國(guó)Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；恒溫培養(yǎng)搖床：蘇坤公司；ＣＨ公司；超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝公司；ＵＶＰ成像凝；紫外分光光度計(jì)：購(gòu)于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；逡逑體及載體逡逑：ｃｏ／0大腸桿菌ＤＨ５ａ和五．ｃｏ／／邋ＢＬ２１（ＤＥ３）是本實(shí)：大腸桿菌原核表達(dá)載體ｐＣｏｌｄ－ＴＦ為本實(shí)驗(yàn)室之前所保存。逡逑－ｃｓｐＡ邋３＇ＵＴＲ逡逑—

用ＨＲＰ標(biāo)記過(guò)的Ｈｉｓ抗體，進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ鑒定。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ印跡結(jié)逡逑果表明，純化后的兩種蛋白在相對(duì)分子量大約為１１０邋ｋＤ處，出現(xiàn)了特異性條帶（見(jiàn)逡逑圖２．３邋Ｂ），和預(yù)期結(jié)果一致。因此，證實(shí)獲得的原核重組融合蛋白就是所需要目逡逑的蛋白。逡逑２．２．３五ｃＧＤＨ的體外酶活分析逡逑為判斷體外的表達(dá)五ｃＧＤＨ蛋白是否ＧＤＨ酶活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)純化之后的目逡逑的蛋白五ｃＧＤＨ進(jìn)行酶活分析。測(cè)量ＧＤＨ催化的還原氨基化反應(yīng)體系內(nèi)ＮＡＤＰＨ逡逑Ａ邐／邐＾邋Ｂ邐了邋Ｚ逡逑ＫＤａ邋Ｚ邋命’邐ＫＤａ逡逑ｉｏ0邋灥邐ｉ00邐Ｗ逡逑７０邐~專(zhuān)哄義�。、�*、ｉ邐７０逡逑５５}瑁擼摺掊危擔(dān)靛義賢跡玻沖澹穡茫錚歟洌裕疲澹悖牽模仍吮澩锏鞍椎模櫻模櫻校粒牽藕停祝澹螅簦澹潁鑠澹猓歟錚舴治鰣義希粒捍炕模齲椋螅裕瓶趙乇昵┑鞍綴停齲椋螅裕疲牛悖牽模鵲鞍�；Ｂ邋：邋｝x椋螅裕瓶趙乇昵┑鞍綴灣義希齲椋螅裕疲澹悖牽模儒宓鞍椎膩澹祝澹螅簦澹潁鑠澹猓歟錚翦寮觳�。辶x希玻板義

本文編號(hào)：2803113