【摘要】：煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)是屬于Geminiviridae科Begomovirus屬的單組分病毒,伴隨β衛(wèi)星(Tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB),在我國云南和四川省廣泛發(fā)生且危害嚴重,是引起番茄和煙草曲葉病的重要病原。我國單組份雙生病毒與β衛(wèi)星的進化關(guān)系及互作機制復雜,TbCSV被認為在進化中介于需要衛(wèi)星的雙生病毒和真正的單組分雙生病毒之間,因此,開展對該病毒及其伴隨衛(wèi)星的研究對于解讀雙生病毒的起源和遺傳進化機制具有重要意義。目前對TbCSV及TbCSB已開展的研究工作主要集中在病毒檢測、致病性、基因功能、蛋白定位、種群變異分析、基因沉默載體構(gòu)建等方面,該病毒在寄主植物體內(nèi)與寄主互作的方式和作用細節(jié),對寄主內(nèi)源基因表達的影響,對寄主生物過程的影響,以及寄主植株對抵抗病毒入侵的響應(yīng)這些問題尚不明確,弄清這些問題將有助于全面解析該病毒的致病機理。本論文擬利用轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學分析方法,分析TbCSV侵染對本氏煙內(nèi)源基因表達的影響,以及這些差異表達基因的功能、作用方式和參與的生物途徑。基于生物信息學分析結(jié)果,借助基因沉默及過表達技術(shù),分析TbCSV及TbCSB侵染對本氏煙光合作用相關(guān)途徑的影響,并明確本氏煙PR和LRR-RLK基因?qū)bCSV及TbCSB侵染的響應(yīng)及本氏煙BR和JA途徑對TbCSV及TbCSB侵染的響應(yīng)。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.病毒侵染對本氏煙內(nèi)源基因表達的影響利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),從TbCSV單獨侵染(TbCSV或Y35A)以及TbCSV與TbCSB共侵染(TbCSV+TbCSB或Y35AB)的本氏煙中共鑒定出59814條基因,其中,3196條基因在Y35A vs CK中差異表達,占基因總數(shù)的5.3%,其中1391條上調(diào)表達,1805條下調(diào)表達;有4081條基因在Y35AB vs CK中差異表達,占基因總數(shù)的6.8%,其中1775條上調(diào)表達,2306條下調(diào)表達。在Y35AB vs CK中的差異表達基因(Differential expression genes,DEGs)共富集3074個GO term,上調(diào)基因和下調(diào)基因分別富集2215和2658個GO term,其中顯著富集GO term 124個,上調(diào)表達和下調(diào)表達的基因各85和166個。Y35A vs CK中的DEGs共富集2966個GO term,上調(diào)基因和下調(diào)基因分別富集2041和2033個GO term,其中顯著性富集GO term 76個,上調(diào)表達和下調(diào)表達的基因各78和66個。這些DEGs主要與生物過程、代謝過程、細胞過程、有機物代謝過程、初級代謝過程等功能相關(guān),參與核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導、代謝途徑、DNA復制、暗反應(yīng)中的固碳作用等過程。隨機篩選了12條基因用RT-qPCR進行驗證,12條基因表達量的變化趨勢與測序結(jié)果一致。進一步分析發(fā)現(xiàn),TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后本氏煙光合作用相關(guān)及防御相關(guān)基因的表達均受到影響,為進一步明確因此進行了以下研究。2.病毒侵染對本氏煙光合作用的影響為明確病毒侵染對寄主光合作用的影響,在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染20d,提取并測定本氏煙葉綠素含量,并對其光合生理特性進行了測定。結(jié)果表明,對照植株葉綠素a的含量為579.7μg/g,TbCSV單獨侵染和TbCSV+TbCSB共侵染植株葉綠素a的含量分別為458.7μg/g和475.0μg/g,顯著低于對照植株。對照植株葉綠素b的含量為141.6μg/g,TbCSV單獨侵染和TbCSV+TbCSB共侵染植株葉綠素b的含量分別為122.3μg/g和126.7μg/g,與對照植株相比有所下降,但差異不顯著。本氏煙光合生理特性測定結(jié)果顯示,與對照植株相比TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后本氏煙凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、氣孔限制值(LS)、水分利用效率(WUE)、光能利用效率(LUE)和CO_2利用效率(CUE)顯著降低,而胞間CO_2濃度(Ci)顯著上升。葉綠素熒光特性測定結(jié)果顯示,與對照植株相比TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后植株非光化學淬滅系數(shù)(qN)和激發(fā)能捕獲效率(Fv'/Fm')上升,電子傳遞速率(ETR)、光化學量子產(chǎn)量(ΦPSII)和光化學淬滅系數(shù)(qP)下降。葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示,TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后導致本氏煙葉綠體數(shù)量減少,TbCSV單獨侵染植株葉綠體中有中等尺寸的淀粉粒積累,TbCSV+TbCSB共侵染接種植株葉綠體形態(tài)腫脹,彎曲變形,內(nèi)部的片層結(jié)構(gòu)因膨壓被擠到一邊。從測序數(shù)據(jù)中篩選了23條同時在TbCSV和TbCSV+TbCSB侵染后表達豐度較高且差異倍數(shù)較大的DEGs,其中15條基因與葉綠體相關(guān),占篩選基因的65%。利用TRV或PVX介導23條目標基因在本氏煙中表達,結(jié)果顯示NbGDCSa、NbGDCSb、NbrbcS、NbChlHa、NbChlHb、NbDXS、NbHemA、NbBchP、NbGRP和NbPU被介導表達后,本氏煙表型發(fā)生變化,主要表現(xiàn)為葉片的黃化、白化、褪綠、斑駁、脈明、萎蔫壞死、卷曲、突起及植株矮化等。這些結(jié)果表明,TbCSV或TbCSV+TbCSB的侵染降低了本氏煙光合作用的能力。3.本氏煙PR和LRR-RLK基因?qū)Σ《厩秩镜捻憫?yīng)為了明確本氏煙PR和LRR-RLK基因?qū)Σ《厩秩镜捻憫?yīng),在前期分析顯示差異表達的基因中隨機篩選了11條PR基因和12條LRR-RLK基因,利用RT-qPCR檢測其在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi、8 dpi和12 dpi時的表達量。結(jié)果顯示,NbPR2、NbPR3、NbPR11(PR基因)和Nb1g56140、Nb1g67720、Nb2g16250、NbEI-LRR(LRR-RLK基因)在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后的3個時間點的表達量均上調(diào);NbPR1、NbPR4、NbPR5、NbPR9、NbPR10a、NbPR17(PR基因)和Nb1g06840、Nb3g47570a、Nb4g26540、Nb4g30520、NbGSO1(LRR-RLK基因)在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后的部分時間點表達量上調(diào),而其余時間點與對照相比差異不顯著;NbPR6、NbPR10b(PR基因)和Nb3g47570b、Nb4g36180、NbFbLRR-MAX2(LRR-RLK基因)在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后有的時間點上調(diào)表達,有的時間點下調(diào)表達。隨機選擇NbPR2、NbPR6、NbPR9、NbPR10a和NbPR11,利用TRV分別介導在本氏煙中表達,檢測TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi、8 dpi和12 dpi時TbCSV及TbCSB的積累量。結(jié)果顯示,NbPR2、NbPR6、NbPR9、NbPR10a沉默后,在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi時TbCSV的積累量均顯著增加,此時TbCSB的積累量在NbPR9和NbPR10a的沉默植株中也顯著增加。而NbPR11沉默后,在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi和8 dpi時TbCSV的積累量均顯著降低,4 dpi時TbCSB的積累量也顯著降低。這些結(jié)果表明,本氏煙PR和LRR-RLK基因?qū)bCSV或TbCSV+TbCSB的侵染作出響應(yīng),部分PR基因?qū)bCSV及TbCSB的積累量具有一定的調(diào)控作用。4.本氏煙BR和JA途徑對病毒侵染的響應(yīng)為了明確BR和JA途徑對病毒侵染的響應(yīng),篩選了6條BR途徑相關(guān)基因和10條JA途徑相關(guān)基因,用RT-qPCR檢測其在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi、8 dpi和12 dpi時的表達量。結(jié)果顯示,NbBZR1、NbCYCD3-X2(BR途徑)和NbDOX1、NbHPL1、NbKAT2、NbJAR1、NbJAZ1、NbJAZ2(JA途徑)在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后的部分時間點表達量上調(diào),而其余時間點與對照相比差異不顯著;NbCYP90C1/D1、NbBRI1、NbBZR2、NbCYCD3-X1(BR途徑)和NbSAMT1、NbSAMT2、NbCOI1、NbMYC2(JA途徑)在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后有的時間點上調(diào)表達,有的時間點下調(diào)表達。本氏煙JA含量檢測結(jié)果顯示,TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染12 dpi對照植株JA的含量為8.89 pg/g,TbCSV單獨侵染植株為14.04 pg/g,TbCSV+TbCSB共侵染植株為12.33 pg/g,TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后JA的含量上升,但未達到顯著水平。因BZR1和CYCD3基因參與調(diào)控植物的生長發(fā)育,為明確本氏煙NbBZR1和NbCYCD3-X1在生長發(fā)育和抗病防御中的作用,以PVX介導本氏煙NbBZR1和NbCYCD3-X1的表達,結(jié)果顯示,NbBZR1過量表達20 d時本氏煙與對照植株相比株高明顯變矮,節(jié)間距變短,頂部葉片出現(xiàn)向下皺縮、變形,上部部分葉片出現(xiàn)均勻分布的白色壞死斑。NbCYCD3-X1過量表達20 d時植株與對照相比可觀察到新葉呈輕微皺縮。目標基因沉默或過表達后,TbCSV及TbCSB的積累量檢測結(jié)果顯示,無論NbBZR1沉默或過表達后,在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi時TbCSV及TbCSB的積累量均顯著降低。NbCYCD3-X1過表達后,在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染4 dpi時TbCSV的積累量顯著降低,但TbCSB的積累量顯著上升。JA途徑受體基因NbCOI1沉默后,TbCSV的積累量在TbCSV單侵染8 dpi和12 dpi時顯著降低,但在TbCSV+TbCSB共侵染3個時間點均顯著上升,而TbCSB的積累量在4 dpi時顯著降低。外源性MeJA和BL處理后,TbCSV及TbCSB的含量變化趨勢在兩種處理方法中一致,在TbCSV單獨侵染4 dpi時TbCSV的含量顯著上升,8 dpi和12 dpi時顯著下降;而在TbCSV+TbCSB共侵染4 dpi和8 dpi時TbCSV及TbCSB的含量顯著下降,12 dpi時TbCSV及TbCSB的含量顯著上升。這些結(jié)果表明,本氏煙BR和JA途徑參與了寄主抗TbCSV及其伴隨衛(wèi)星的侵染。5.BR和JA途徑在響應(yīng)病毒侵染過程中發(fā)生相互作用研究發(fā)現(xiàn),BL處理本氏煙12 h后JA途徑基因NbCOI1的表達量顯著上升,在TbCSV單獨侵染3個時間點的表達量均上升,在TbCSV+TbCSB共侵染4 dpi和12 dpi時也上升。MeJA處理6 h和12 h后NbBRI1的表達量均顯著上升,在TbCSV單獨侵染4 dpi和8 dpi時表達量上升,在TbCSV+TbCSB共侵染4 dpi和12 dpi時的表達量也上升。MeJA+BL共同處理后12 h NbCOI1和NbBRI1的表達量均顯著上升,在TbCSV單獨侵染的3個時間點,NbCOI1和NbBRI1的表達量均上升,在TbCSV+TbCSB共侵染4 dpi時,NbCOI1和NbBRI1的表達量也均上升。以上結(jié)果表明,MeJA處理后在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染前后,BR途徑受體基因NbBRI1被誘導上調(diào)表達。同樣,BL處理后在TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染前后,JA途徑受體基因NbCOI1也被誘導上調(diào)表達。同時,MeJA+BL共同處理后NbBRI1和NbCOI1均有被誘導上調(diào)表達。由此推測,MeJA和BL處理相互促進了彼此信號通路中受體基因的表達量上調(diào),表明BR和JA途徑在參與本氏煙對TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染的調(diào)控過程中存在相互促進作用。本研究中,轉(zhuǎn)錄組分析表明TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后本氏煙內(nèi)源基因的表達受到不同程度的影響,涉及本氏煙各項生理功能和生物過程。研究結(jié)果表明,TbCSV或TbCSV+TbCSB侵染后本氏煙光合作用能力降低。同時,本氏煙PR和LRR-RLK基因,以及BR和JA途徑參與了本氏煙抗TbCSV及其伴隨衛(wèi)星的侵染,并參與調(diào)控病毒及衛(wèi)星的積累量。這些研究結(jié)果可為解析TbCSV及其伴隨衛(wèi)星與寄主相互作用的分子機制,以及寄主抗病機制提供科學依據(jù)。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41

【參考文獻】

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本文編號：2800516