【摘要】：褐飛虱(Nilaparvata lugens St?l)是一種水稻單食性害蟲,具有遷飛性、繁殖力強等特點,經(jīng)常給水稻生產(chǎn)造成巨大的損失。我們在研究褐飛虱與抗性水稻互作的過程中,發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)基因和通路發(fā)生了不同程度的差異表達(dá)。線粒體在ATP合成、氧化應(yīng)激、鈣信號傳遞和細(xì)胞凋亡等生命活動過程發(fā)揮重要作用。線粒體自噬(mitophagy)是細(xì)胞通過自噬選擇性降解線粒體的過程,可以清除功能失調(diào)的線粒體。線粒體自噬是細(xì)胞的一種自穩(wěn)態(tài)調(diào)控和適應(yīng)機制。但線粒體自噬與褐飛虱適應(yīng)抗性水稻的關(guān)系并未見報道。因此,鑒定褐飛虱中自噬相關(guān)基因,研究其在褐飛虱中的表達(dá)規(guī)律及功能,有助于進(jìn)一步揭示線粒體自噬在褐飛虱適應(yīng)抗性水稻中的作用。本研究克隆了褐飛虱線粒體ATP合酶ɑ亞基和β亞基的編碼基因(NlATPSɑ和NlATPSβ)以及ATG8泛素結(jié)合通路中的3個自噬相關(guān)基因(NlATG3、NlATG4和NlATG8),采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了上述基因在褐飛虱不同發(fā)育階段、不同性別或不同組織部位中的表達(dá)規(guī)律,采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究了NlATPSɑ、NlATPSβ、NlATG3和NlATG4等基因的功能。研究結(jié)果如下:一、褐飛虱NlATPSɑ和NlATPSβ的克隆及功能研究利用RACE技術(shù)克隆得到NlATPSɑ基因2131 bp的全長cDNA,其1656 bp的開放閱讀框編碼551個氨基酸;NlATPSβ基因1578 bp的開放閱讀框編碼525個氨基酸。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),NlATPSɑ和NlATPSβ基因的表達(dá)規(guī)律相似:2個基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá),且在若蟲期的表達(dá)量要高于成蟲期;另外,NlATPSɑ和NlATPSβ基因在雄蟲中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于雌蟲,二者之間的差異達(dá)到了極顯著水平(P0.01)。采用注射法對NlATPSɑ和NlATPSβ基因進(jìn)行RNA干擾,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個基因在干擾后的第4天,干擾組的表達(dá)量均明顯下降,與對照組達(dá)到極顯著差異(P0.01),RNAi可以導(dǎo)致蟲體ATP含量的減少,造成一定數(shù)量的試蟲死亡,到第7天時的存活率分別下降為對照的45%和40%。二、褐飛虱自噬相關(guān)基因NlATG3、NlATG4和NlATG8的克隆及功能研究利用RACE技術(shù)克隆獲得NlATG3、NlATG4和NlATG8基因的cDNA,其中,NlATG3基因990 bp的開放閱讀框編碼329個氨基酸,NlATG4基因1140 bp的開放閱讀框編碼379個氨基酸,NlATG8基因360 bp的開放閱讀框編碼119個氨基酸。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),NlATG3、NlATG4和NlATG8基因在不用發(fā)育階段和不同性別間的表達(dá)規(guī)律相似:3個基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá),且在若蟲期的表達(dá)量要高于成蟲期;另外,NlATG3和NlATG8基因的表達(dá)量在雄蟲中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于雌蟲,二者之間的差異達(dá)到了極顯著水平(P0.01),NlATG4基因的在雄蟲中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于雌蟲,二者之間的差異達(dá)到了顯著水平(P0.05)。在褐飛虱不同組織部位中的表達(dá)規(guī)律各不相同:NlATG3基因在不同組織部位中均有表達(dá),且在頭部的表達(dá)量最低;NlATG4基因在不同組織部位中均有表達(dá),而在胸部的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織;NlATG8基因在胸部基本不表達(dá)。采用注射法對NlATG3和NlATG4基因進(jìn)行RNA干擾,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干擾后的第4天,2個基因的表達(dá)量均大幅下降,與對照組達(dá)到極顯著差異(P0.01);RNAi可以導(dǎo)致蟲體ATP含量的減少;NlATG4基因RNAi后,試蟲的組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化,中腸細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的空泡化,靠近腸絨毛的線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)較對照組顯得十分模糊,脂肪體間的組織結(jié)構(gòu)完整性受到破壞,且其體內(nèi)的菌的界限不清晰;NlATG3基因RNAi后的試蟲死亡明顯,第7天的存活率不到10%,而NlATG4基因RNAi后的第7天存活率下降為對照的50%。綜上,本研究克隆、鑒定了部分線粒體自噬相關(guān)的基因,明確了目標(biāo)基因的表達(dá)規(guī)律,初步研究了目標(biāo)基因的功能。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示線粒體自噬在褐飛虱中的作用奠定了基礎(chǔ),為褐飛虱的防治提供了新的思路和潛在靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：中國計量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.112.3
【圖文】：

圖 1.1 自噬的分類[25]自噬相關(guān)基因噬相關(guān)基因（autophagy-related gene, Atg）是細(xì)胞自噬過程中的關(guān)最先是在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)的[30]。Atg對保守的，在酵母中發(fā)現(xiàn)的 38 個 ATG 基因，近一半可以在哺乳動到其同源蛋白[31]。自噬相關(guān)基因可以根據(jù)其在自噬過程中所發(fā)揮的為以下幾類：1）Atg1/ULK 復(fù)合物（Atg1, Atg11, Atg13, Atg17, A是調(diào)控誘導(dǎo)自噬體形成的起始復(fù)合物；2）Atg9 及其循環(huán)系統(tǒng)（At18）在 Atg1 復(fù)合物組裝到 PAS 后吞噬泡的擴大運輸上起了很大的3 激酶（PtdIns 3K）復(fù)合物（Vps34, Vps15, Vps30/Atg6, 和 Atg1成核階段發(fā)揮作用，涉及 PtdIns3P 結(jié)合蛋白招募到 PAS 上；4）兩統(tǒng)：Atg12（Atg5, Atg7, Atg10, Atg12 和 Atg16）和 Atg8（Atg3, At8）結(jié)合系統(tǒng)在囊泡擴張過程中起到重要作用[32]。

2 ubiquitinnjugationsystemAtg5autophagosome formation[67-68]; Phosphorylation of results in impaired autophagy[69]; regulates plasmadifferentiation[70]Atg7E1-like enzyme, is essential for the two impubiquitination-like conjugation system, the formatiautophagosomes, and starvation-induced degradatioproteins and organelles[62-64]Atg10 E2-like enzyme[71]; Conjugates Atg12 to Atg5[72]Atg16Interacts with Atg12 and Atg5, is absolutely requirautophagy induction by affecting the formatioautophagosomes[73-74]3 自噬過程及檢測方法自噬的發(fā)生可以分為以下五個階段：1）自噬的誘導(dǎo)，2）吞噬泡的成核泡的延伸與自噬體的形成，4）對接和融合，5）降解和流出[75]（圖 1.2自噬發(fā)生的因素有很多，例如營養(yǎng)饑餓、缺氧或是各種化學(xué)試劑如雷帕都會誘導(dǎo)自噬發(fā)生，其中氨基酸饑餓是最有效的[76-77]。

圖 2.1 PCR 擴增電泳圖注：A 圖，NlATPSɑ 核心驗證； B 圖，NlATPSɑ RACE 擴增；C 圖，NlATPSβ 全長序列.2.7.2 褐飛虱NlATPSɑ 和NlATPSβ 基因的cDNA全長序列及其編碼的氨基酸序列分析使用 ORF Finder 分析發(fā)現(xiàn)，NlATPSɑ 基因 cDNA 的全長為 2131 bp，包括38 bp 的 5’非編碼區(qū)（5’UTR），編碼 551 個氨基酸的 1656 bp 開放閱讀框（ORF）和434 bp 的 3’非編碼區(qū)（3’UTR），且3’端有典型的polyA 結(jié)構(gòu)（圖 2.2）。NlATPSβ基因的 1578 bp 開放閱讀框編碼 525 個氨基酸（圖 2.3）。ExPASy 軟件分析發(fā)現(xiàn)NlATPSɑ 基因編碼的蛋白分子量為 59.57 kDa，等電點（pI）為 9.03；NlATPSβ 基因編碼的蛋白分子量為 56.02 kDa，等電點（pI）為 5.14。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)NlATPSα 基因有一個 N-末端（位于 67-133 個氨基酸）和 C-末端（位于 420-545個氨基酸）結(jié)構(gòu)域；NlATPSβ 基因有一個 N-末端（位于 60-126 個氨基酸）和C-末端（位于 408-518 個氨基酸），第 195-379 個氨基酸編碼一個 AAA+ ATPase結(jié)構(gòu)域，具體見圖 2.3 的下劃線。

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本文編號：2799097