【摘要】：萊茵衣藻作為模式物種,在微藻研究中廣泛使用。它是目前唯一能在細(xì)胞核、葉綠體和線(xiàn)粒體三套遺傳系統(tǒng)中都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的真核藻類(lèi)。雖然萊茵衣藻的細(xì)胞核轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)較成熟,外源DNA分子能高效整合入細(xì)胞核基因組中,但這種整合是隨機(jī)插入為主。到目前為止萊茵衣藻核基因的定向敲除、替換技術(shù)尚未有效建立,如何高效進(jìn)行基因組特定區(qū)域DNA的插入、敲除和替換?成為萊茵衣藻基因編輯的瓶頸。針對(duì)萊茵衣藻同源重組效率低的問(wèn)題,本論文從Ku基因和條件致死基因codA兩方面進(jìn)行研究,探討衣藻內(nèi)源Ku基因敲除/失活對(duì)其核基組同源重組的影響,探索在萊茵衣藻利用codA進(jìn)行反向篩選的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:我們能夠在內(nèi)源Ku基因失活藻株的maa7位點(diǎn)整合外源基因,初步完成了基因編輯;codA轉(zhuǎn)基因工程藻生長(zhǎng)基本不受影響,僅在5-FC的誘導(dǎo)下死亡,說(shuō)明了萊茵衣藻反向篩選的可行性。這些均為萊茵衣藻定向編輯技術(shù)體系的建立奠定研究基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.根據(jù)萊茵衣藻密碼子偏好性改造大腸桿菌codA基因,獲得了長(zhǎng)度為1311bp的優(yōu)化基因(crcodA),并構(gòu)建了含有熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子的pJ1D-crcodA表達(dá)載體,通過(guò)“珠磨法”轉(zhuǎn)入萊茵衣藻CC849細(xì)胞核中,經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證,獲得了工程藻codA1和codA3。熒光定量PCR結(jié)果表明codA基因在工程藻codA3中的表達(dá)量要高于在工程藻codA1中,且熱誘導(dǎo)使其在工程藻中表達(dá)量提高約1倍。采用5-FC作為致死誘導(dǎo)物的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)5-FC濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)會(huì)對(duì)工程藻產(chǎn)生毒性,并且毒性強(qiáng)弱與藻細(xì)胞濃度有關(guān),僅當(dāng)藻細(xì)胞濃度低于8×10~2 cells/m L時(shí),5-FC會(huì)導(dǎo)致工程藻codA3細(xì)胞死亡。葉綠素含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5-FC致死誘導(dǎo)后工程藻的葉綠素含量顯著降低,較野生型低1倍左右,但熱誘導(dǎo)并未對(duì)工程藻的葉綠素含量造成顯著改變,表明熱誘導(dǎo)對(duì)5-FC的致死誘導(dǎo)效果影響不大。2.為提高codA在衣藻中的致死效果,用組成型啟動(dòng)子PsaD替換熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子Hsp70-RBCS2,并進(jìn)一步構(gòu)建了crcodA+crupp基因的融合表達(dá)載體pDb-crcodAupp。首先根據(jù)萊茵衣藻密碼子偏好性改造大腸桿菌upp基因,獲得了長(zhǎng)度為648bp的優(yōu)化基因(crupp),接著構(gòu)建了pDb-crcodAupp表達(dá)載體,最后通過(guò)“珠磨法”將其轉(zhuǎn)入萊茵衣藻細(xì)胞核中,獲得了高融合表達(dá)crcodAupp基因的工程藻upp1和upp2。5-FC致死誘導(dǎo)研究表明,當(dāng)5-FC濃度為5 mg/mL時(shí)會(huì)對(duì)工程藻產(chǎn)生毒性,當(dāng)藻細(xì)胞濃度低于1×10~5cells/mL時(shí)工程藻的生長(zhǎng)被顯著抑制,而藻細(xì)胞濃度低于1×10~3 cells/mL時(shí),所有工程藻都死亡。這表明經(jīng)改良后codA基因能使萊茵衣藻在特定條件下(添加5-FC)完全死亡,證明利用codA在萊茵衣藻中進(jìn)行反向篩選是可行的。3.在萊茵衣藻基因組中預(yù)測(cè)了兩個(gè)Ku類(lèi)蛋白基因crKu70,crKu80,并從衣藻突變庫(kù)中篩選出可能的crKu70,crKu80失活突變?cè)錮KU70和dKU80。劃線(xiàn)純化可能的失活突變?cè)搴?以PCR測(cè)序檢測(cè)它們的基因型。結(jié)果顯示藻株dKU70基因組在crKu70基因的第8個(gè)內(nèi)含子中發(fā)生了外源抗性基因(CIB1 cassette)的反向插入,且抗性基因在插入時(shí)丟失了3'末端265個(gè)堿基;藻株dKU80基因組在cr Ku80基因的第5個(gè)外顯子中發(fā)生了整個(gè)抗性基因的正向插入。該結(jié)果從基因水平證實(shí)藻株dKU70和dKU80確為內(nèi)源cr Ku70,cr Ku80失活的突變?cè)�。因Ku類(lèi)蛋白與DNA損傷修復(fù)有關(guān),藻株dKU70和dKU80均對(duì)DNA損傷劑敏感,但dKU80較dKU70更敏感。該結(jié)果從功能角度進(jìn)一步驗(yàn)證dKU70和dKU80為內(nèi)源Ku類(lèi)基因失活藻。鑒于dKU80的表型更明顯,選擇該藻進(jìn)行后續(xù)基因編輯研究。4.選取萊茵衣藻內(nèi)源maa7基因?yàn)榘谢?構(gòu)建了同源重組載體pMD19T-maa7LRhyg,該載體含有由maa7上游1kb、潮霉素抗性基因、maa7下游1kb組成的重組單元。重組載體轉(zhuǎn)化藻株dKU80,通過(guò)潮霉素和5-氟吲哚篩選獲得轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)表明,同源重組單元成功在藻株dKU80的maa7基因處發(fā)生了基因替換。該結(jié)果初步證實(shí)內(nèi)源Ku80基因失活藻株能夠在特定位置進(jìn)行定向基因編輯。綜上所述,一方面本研究利用基因工程手段獲得了crcodA+crupp基因融合表達(dá)的工程藻,證實(shí)了codA基因在萊茵衣藻核基因編輯中作為反向篩選標(biāo)記的可行性;另一方面獲得了內(nèi)源Ku類(lèi)蛋白失活的突變?cè)?證實(shí)通過(guò)同源重組載體的方式能夠在crKu80失活藻中初步實(shí)現(xiàn)基因組定向編輯。本論文為萊茵衣藻的同源重組技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了有益探索,開(kāi)拓了新思路,為萊茵衣藻定向編輯技術(shù)體系的建立奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【圖文】：

圖 1-1 ZFNs 作用原理示意圖（Carlson[4]) 轉(zhuǎn)錄激化效應(yīng)核酸酶技術(shù)轉(zhuǎn)錄激化效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases, TALENss 的替代物已成為植物中有效的基因組編輯工具。原則上，TALENs 與 ZFNs利用 DNA 雙鏈斷裂來(lái)進(jìn)行基因編輯（圖 1-2）[15]。 此外，TALENs 與 ZFNs有非特異性 Fok I 核酸內(nèi)切酶。然而，TALENs 是由 ZFNs 的 Fok I 切割結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激化效應(yīng)物（TALE）高度保守且重復(fù)的特定 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合形成ENs 蛋白是在黃單胞桿菌中發(fā)現(xiàn)的，其分泌的 TALE 可以改變宿主植物中的基, 18]。TALE 的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含高達(dá) 30 個(gè)拷貝的 33-34 個(gè)氨基酸序列且高除了第 12 和 13 位置上的氨基酸。第 12 位和第 13 位氨基酸被稱(chēng)為重復(fù)可變雙基序列（repeat-variable diresidue ,RVD），與特定的核苷酸識(shí)別具有實(shí)質(zhì)相關(guān)性復(fù)序列都可以識(shí)別單個(gè)堿基，因此可以為任何 DNA 序列組裝新的結(jié)合位點(diǎn)[1

圖 1-2 TALENs 作用原理示意圖（Mahfouz[15]）1.1.3 成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/ Cas 是細(xì)菌中常見(jiàn)的 DNA 序列家族其包含入侵細(xì)菌的病毒 DNA 片段，這些 DNA 片段可以被細(xì)菌用來(lái)識(shí)別和破壞 DNA其免受進(jìn)一步的攻擊，從而保護(hù)自己[24]。 CRISPR / Cas 可以充當(dāng)細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，細(xì)菌提供抵抗外來(lái)遺傳物質(zhì)的抗性。CRISPR 系統(tǒng)包括 CRISPR RNA（crRNA），反激活 CRISPR RNA（tracrRNA），Cas9 核酸酶和原型間隔區(qū)相鄰基序（PAM）。天然在的 CRISPR 系統(tǒng)是將外源 DNA 序列整合到 CRISPR 簇中，然后，含有外源 DNA列的 CRISPR 簇產(chǎn)生與其位點(diǎn)互補(bǔ)的 PAM 區(qū)的 crRNA（約 40nt）。 crRNA 與 tracrR雜交形成 guide RNA（gRNA）。gRNA 激活 Cas9 系統(tǒng)并結(jié)合 Cas9。gRNA 5' 末端20 個(gè)核苷酸指導(dǎo) Cas9 核酸酶與靶 DNA 進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而導(dǎo)致 RNA-DNA 互

圖 1-3 CRISPR / Cas9 作用原理示意圖（Sander[25]）.2 同源重組同源重組 (homologous recombination, HR) 技術(shù)是基因工程研究方面技術(shù)手段，在基因克隆和基因打靶方面起著重要作用。在 DNA 同源序生 HR，此外近乎所有的生物體中都會(huì)發(fā)生 HR，如真核生物中發(fā)生的之間的交換，姐妹染色單體之間的交換，細(xì)菌以及某些低等真核生物的導(dǎo)，接合，噬菌體的重組等都屬于此類(lèi)重組方式[40]。另外，HR 還經(jīng)鏈斷裂的細(xì)胞中，是雙鏈斷裂修復(fù)中一種重要的修復(fù)模式，對(duì)基因組具有舉足輕重的地位。RecA 重組系統(tǒng)是大腸桿菌自身攜帶的，由 RecA 家族蛋白和 RecB。其中 RecA 基因編碼的 RecA 蛋白是 RecA 家族蛋白的第一個(gè)成員，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 占大錢(qián);黃志勇;陳孝平;;Ku蛋白與腫瘤[J];世界華人消化雜志;2006年22期

2 韓聰,張惟材,游松;Red同源重組技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物工程雜志;2003年12期

3 卞廣興,郭葆玉;DNA雙鏈斷裂與同源重組修復(fù)機(jī)理研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2001年02期

本文編號(hào)：2795076