【摘要】：胰島素樣促雄性腺激素(Insulin-like androgenic gland hormone,IAG)是由甲殼動(dòng)物雄性特有促雄性腺(Androgenic gland,AG)所分泌,在性別分化和維持雄性次級(jí)性別特征中起重要作用。然而墨吉明對(duì)蝦(Fenneropenaeus merguiensis)性別分化分子機(jī)制的研究仍在初步階段。因此,研究其性別分化相關(guān)基因的分子特征,可以為闡明墨吉明對(duì)蝦性別分化分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)首次克隆得到墨吉明對(duì)蝦胰島素樣促雄性腺激素IAG基因的c DNA全長(zhǎng)、基因組DNA以及5’側(cè)翼片段,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(q RT-PCR)進(jìn)行Fm IAG基因在墨吉明對(duì)蝦不同組織、不同蛻皮時(shí)期以及幼體發(fā)育期的表達(dá)特征分析;通過(guò)RNA干擾(RNAi)技術(shù)和q RT-PCR技術(shù)對(duì)Fm IAG基因與其他性別相關(guān)基因的關(guān)系進(jìn)行了分析探討;運(yùn)用q RT-PCR技術(shù)對(duì)Fm IAG基因與眼柄神經(jīng)節(jié)分泌物質(zhì)關(guān)系進(jìn)行了初步研究。本研究克隆得到Fm IAG基因的c DNA全長(zhǎng)為2092 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)為510bp,其編碼169個(gè)氨基酸。墨吉明對(duì)蝦IAG多肽是由一個(gè)信號(hào)肽(34 aa)和一個(gè)成熟肽(135 aa)組成,其成熟肽由B鏈、C肽和A鏈構(gòu)成,B鏈與C肽的切割位點(diǎn)為RVSR,C肽與A鏈的切割位點(diǎn)RVKR。Fm IAG成熟肽中6個(gè)Cys殘基在甲殼動(dòng)物中高度保守。預(yù)測(cè)的N端糖基化位點(diǎn)Asn37位于B鏈。以上Fm IAG基因的氨基酸結(jié)構(gòu)特征跟大多數(shù)動(dòng)物IAG基因類(lèi)似。Fm IAG物種進(jìn)化樹(shù)表明Fm IAG與對(duì)蝦類(lèi)聚為一支,且與中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的IAG基因的同源性最高,分別為91%、81%和80%。但與其他甲殼動(dòng)物IAG的基因結(jié)構(gòu)特征不盡相同,Fm IAG基因只有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。Fm IAG基因5’側(cè)翼序列與中國(guó)明對(duì)蝦IAG基因5’側(cè)翼序列具有高度同源性(80%),它們具有幾個(gè)相同的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn):TBP、Fox F1、Sp1、Ste11+、AR和TEF-1等。qRT-PCR結(jié)果顯示,Fm IAG在墨吉明對(duì)蝦促雄性腺AG中極顯著表達(dá),而在對(duì)蝦其他組織均未檢測(cè)到Fm IAG的表達(dá);在蛻皮周期中,墨吉明對(duì)蝦Fm IAG基因在蛻皮間期后期的表達(dá)量很低,直到蛻皮前期之后及蛻皮后期之前逐漸升高,最后到蛻皮間期的早期轉(zhuǎn)錄水平下降至最低;Fm IAG基因在幼體發(fā)育期中均檢測(cè)的到,但在無(wú)節(jié)幼體后期表達(dá)量最高。運(yùn)用RNAi技術(shù),沉默F(xiàn)m IAG基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Fm IAG的表達(dá)量在第72 h表達(dá)量降至最低;同時(shí)發(fā)現(xiàn)在Fm IAG-ds RNA注射入對(duì)蝦體內(nèi)后的第24小時(shí),在精巢和肝胰腺中分別出現(xiàn)了卵黃蛋白原基因Vg1和Vg2的表達(dá);Fm VASA基因在精巢中的表達(dá)量有微弱的下降;而Fm CHH-like基因在促雄性腺中的表達(dá)量在第72 h時(shí)下降至最低,其變化規(guī)律與Fm IAG基因的極度相似,推測(cè)Fm CHH-like基因可能參與Fm IAG基因的表達(dá)調(diào)控。q RT-PCR顯示單側(cè)眼柄摘除實(shí)驗(yàn)及在體外組織孵育實(shí)驗(yàn)表明眼柄神經(jīng)節(jié)分泌物質(zhì)能夠直接作用于Fm IAG,且對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控。綜上所述,對(duì)墨吉明對(duì)蝦Fm IAG基因的相關(guān)分子特征研究為雄性性別控制機(jī)制研究提供了更深入的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖1-1墨吉明對(duì)蝦Figure 1-1 Fenneropenaeus merguiensis國(guó)就已經(jīng)對(duì)墨吉明對(duì)蝦的胚胎發(fā)育和育苗等生仍未突破技術(shù)難關(guān)。目前為止，對(duì)墨吉明對(duì)害防控以及環(huán)境因子脅迫等方面。吉明對(duì)蝦克隆得到了 C 型溶菌酶基因 Lyz (F 血 弧 菌 (Vibrio parahaemolyticus) 、 溶 壁 微答模式，結(jié)果表明，F(xiàn)mLyz 參與了墨吉明對(duì)同鹽度和溫度能夠?qū)δ鲗?duì)蝦胚胎發(fā)育產(chǎn)酸鹽環(huán)境因子的毒性對(duì)墨吉明對(duì)蝦的免疫因于墨吉明對(duì)蝦生產(chǎn)方面的研究，而有關(guān)墨吉的研究仍是空白。決定與性別分化的研究進(jìn)展別形成一般有兩個(gè)過(guò)程，包括性別決定和性

圖1-2促雄性腺研究的重要?dú)v程Figure 1-2 The important process for the study of the androgenic gland1.2.1 促雄性腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)及位置關(guān)于十足類(lèi)動(dòng)物 AG 的形態(tài)結(jié)構(gòu)及位置的研究詳見(jiàn)表 1-1。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，甲動(dòng)物的 AG 都是伴生于雄性生殖系統(tǒng)附近，但不同種類(lèi)，其腺體形狀各異，位置也盡相同。表1-1十足類(lèi)動(dòng)物AG的形態(tài)結(jié)構(gòu)及位置Table 1-1 The morphological structure and position of theAG物種Species腺體位置Position of gland腺體形狀Shape of gland參考文Referenc厚紋蟹(Pachygrapsus crassipes)纏繞在輸精管上 呈索狀 [30]中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)附著在左右射精管的表面呈不規(guī)則索狀 [31]三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)位于左右射精管外表面呈不規(guī)則索狀 [32]

24圖2-4 FmIAG與FcIAG基因啟動(dòng)子序列比對(duì)。示意圖中，轉(zhuǎn)錄因子包括FoxF1、Sp1、TEF-1、TBP(TATAA盒結(jié)合位點(diǎn))等，用黃色標(biāo)記。加粗和下劃線(xiàn)標(biāo)記的為核心啟動(dòng)子(CORE promoter)序列。Figure 2-4 FmIAG and FcIAG gene promoter sequence alignment. Transcription factors include FoxF1, Sp1,TEF-1, TBP (TATAAbox binding sit), etc., with yellow marks. Bold and underlining marks the CORE promotersequence.

【參考文獻(xiàn)】

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1 李法君;青蝦IAG及相關(guān)基因的克隆及調(diào)控關(guān)系的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2786367