發(fā)布時(shí)間：2020-08-08 00:08

【摘要】：蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola(Schw.)Wiltshire)侵染導(dǎo)致的黑斑病是十字花科蔬菜生產(chǎn)上的重要病害之一,在蔬菜的田間生長(zhǎng)期和儲(chǔ)藏期均可危害,嚴(yán)重影響到該類蔬菜的產(chǎn)量、品質(zhì)和安全性。但是對(duì)于其防控至今還未找到非常有效的措施。分生孢子在真菌的致病過程中起著重要的作用,因此查找蕓薹生鏈格孢的產(chǎn)孢相關(guān)基因并對(duì)產(chǎn)孢機(jī)制進(jìn)行研究,將有助于深入認(rèn)識(shí)其致病機(jī)制,從而為病害的防治提供新的策略。本研究對(duì)前期構(gòu)建的蕓薹生鏈格孢轉(zhuǎn)化子庫進(jìn)行了篩選,共得到了19株產(chǎn)孢缺陷突變體,利用Hitail-PCR技術(shù)對(duì)產(chǎn)孢缺陷突變體的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行克隆,得到了突變體M85的右翼序列,序列分析顯示該右翼序列為酵母轉(zhuǎn)錄因子Ndt-80同源基因,命名為Abcdm1(A.brassicicola conidiation-deficiency mutant)。對(duì)Abcdm1基因進(jìn)行了克隆和序列分析,同時(shí)根據(jù)同源重組原理,采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法,獲得1個(gè)基因敲除突變體ΔAbcdm1和1個(gè)回復(fù)突變體C,并進(jìn)行了生物學(xué)功能分析,研究結(jié)果如下:對(duì)蕓薹生鏈格孢轉(zhuǎn)化子庫進(jìn)行了產(chǎn)孢缺陷突變體的篩選,共得到了19株產(chǎn)孢降低的突變體,其中產(chǎn)孢能力完全喪失的有13株,分別M17,M37,M51,M56,M73,M85,M131,M96,M101,M133,M159,M204,M324;產(chǎn)孢能力顯著降低的有6株,為M15,M108,M122,M183,M258,M177。Hitail-PCR得到了M85突變體的右翼序列,為酵母轉(zhuǎn)錄因子Ndt-80同源基因,命名為Abcdm1。對(duì)Abcdm1基因進(jìn)行了擴(kuò)增和分析,該基因全長(zhǎng)1905 bp,cDNA 1632 bp,編碼543個(gè)氨基酸,并發(fā)現(xiàn)該基因與其它真菌同源性較低。Abcdm1基因參與蕓薹生鏈格孢的菌絲生長(zhǎng)調(diào)控,突變體ΔAbcdm1氣生菌絲變長(zhǎng),呈絨毛狀,菌絲純白,無黑色素,但是突變體菌落生長(zhǎng)速度與野生型菌株一致。Abcdm1基因參與調(diào)控蕓薹生鏈格孢的產(chǎn)孢,突變體ΔAbcdm1產(chǎn)孢能力完全喪失。Abcdm1基因參與蕓薹生鏈格孢的脅迫調(diào)控,突變體ΔAbcdm1對(duì)KCl和NaCl敏感性升高,對(duì)氧脅迫因子H_2O_2敏感性較低。Abcdm1基因參與體外穿透力的調(diào)控,突變體ΔAbcdm1體外穿透能力完全消失,但是致病性與野生型相比無差異。Abcdm1基因參與營養(yǎng)代謝的調(diào)控。突變體ΔAbcdm1對(duì)碳源和氮源的營養(yǎng)應(yīng)答的反應(yīng)不同。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上MM上加入葡萄糖之后,我們發(fā)現(xiàn)突變體幾乎不生長(zhǎng)。然而在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入BSA之后,突變體可以進(jìn)行生長(zhǎng)。綜上所述,在蕓薹生鏈格孢(A.brassicicola)中Abcdm1基因參與脅迫敏感性的應(yīng)答、營養(yǎng)代謝的應(yīng)答和體外穿透力。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.4
【圖文】：

圖 1. ΔAbcdm1 突變體篩選驗(yàn)證相關(guān)的引物設(shè)計(jì)示意圖Fig1. Relative primers locations for Abcdm1 screening verification are indicated on the schematic diagram采用 CTAB 提取轉(zhuǎn)化子全基因組 DNA。根據(jù)同源重組原理分析，設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物Abcdm1-YF/hph3、hph1/hph2，引物設(shè)計(jì)原理如圖 1。采用普通 PCR 方法，同時(shí)與野生菌對(duì)比分析，從而篩選出基因缺失突變體 ΔAbcdm1。2.2.12.3 Southern blot 驗(yàn)證 Abcdm1 基因缺失轉(zhuǎn)化子通過 Southern blot 進(jìn)一步驗(yàn)證得到的突變體是否是單拷貝。提取野生型菌株和突變菌株的基因組 DNA，經(jīng)合適的限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行凝膠電泳，以 hph 引物（hph1/hph2）從質(zhì)粒 pUCATPH 上擴(kuò)增 hph 片段（1046 bp）制備探針進(jìn)行 Southern blot分析。Southern blot 過程參考羅氏地高辛標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)（DIG High PrimeDNA 標(biāo)記及雜交檢測(cè)試劑盒Ⅱ）。突變體雜交條帶為一條時(shí)是正確的轉(zhuǎn)化子。(1) 基因組 DNA 的酶切

產(chǎn)孢缺陷突變體的篩選Fig.2Screeningofconidiation-deficiencymutantsM258M204M183M324

26圖 3 Hitail-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析M1：Marker DL2000 ；M2：Marker 2000 plusFig3. Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresisM1: Marker DL2000 ; M2: Marker 2000 plus帶進(jìn)行回收測(cè)序，其中 M85 菌株測(cè)序成功，有效因?yàn)闈舛忍突蛘邷y(cè)序雙峰而導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果失敗，結(jié)果顯示其包括了 603bp 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶載體 側(cè) 序 列 的 422 bp 放 入 蕓 薹 生 鏈 格 孢 全 基.gov/Altbr1/Altbr1.home.html）中進(jìn)行查詢和比對(duì)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

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本文編號(hào)：2784730