【摘要】：紫杉醇是臨床上廣泛使用的抗癌藥物,主要從紅豆杉植物中提取獲得,但天然提取得到的紫杉醇遠(yuǎn)不能滿足臨床需求,尋求新的紫杉醇藥源途徑迫在眉睫,發(fā)展合成生物學(xué)技術(shù)是解決紫杉醇供需矛盾的重要途徑。目前,紫杉醇生源路徑中大部分酶的基因已被確認(rèn),但尚有母核上較多細(xì)胞色素P450羥化酶基因及其功能未被確認(rèn),尤其是母核上C1、C4和C9位對(duì)應(yīng)的細(xì)胞色素P450羥化酶基因尚未發(fā)現(xiàn),這是目前研究紫杉醇合成生物學(xué)技術(shù)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本課題基于中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)紅豆杉CYP450基因進(jìn)行系統(tǒng)鑒定,通過功能注釋及表達(dá)差異分析,挖掘紫杉醇生物合成相關(guān)的新的羥化酶候選基因,并通過基因克隆及功能研究進(jìn)行候選基因的確認(rèn)。取得的主要研究結(jié)果如下:1)中國(guó)紅豆杉CYP450基因的系統(tǒng)鑒定基于中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)了118個(gè)全長(zhǎng)和175個(gè)非全長(zhǎng)的中國(guó)紅豆杉CYP450基因。其中,除了5個(gè)基因(TcCYP725A1,TcCYP725A2,TcCYP725A4,TcCYP725A5,TcCYP725A6)被報(bào)道,以及另一個(gè)TcCYP725A3與已知的東北紅豆杉的CYP725A3同源性達(dá)99%外,絕大多數(shù)CYP450基因都由本文首次發(fā)現(xiàn)。獲得的118個(gè)中國(guó)紅豆杉全長(zhǎng)CYP450經(jīng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化分類和命名,被分為8個(gè)聚類(clan)和29個(gè)家族,同時(shí)被分為兩個(gè)類別:A-type和non-A-type。其中,52個(gè)基因(44.1%)屬于A-type(71 clan),歸屬于11個(gè)家族,剩下的66個(gè)基因(55.9%)為non-A-type,分屬于18個(gè)家族和7個(gè)clan。其中,在non-A-type中還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的CYP450家族,即CYP864和CYP947。進(jìn)化分析表明,中國(guó)紅豆杉CYP450的遺傳組成與裸子植物云杉較為一致,而與被子植物擬南芥、苜蓿等有較大差異。中國(guó)紅豆杉CYP450s雖然高度分化成多個(gè)家族,但仍然有著結(jié)構(gòu)上的保守特征,包括PFG element,PERF motif,K-helix region和I-helix region。2)紫杉醇生物合成相關(guān)CYP450羥化酶候選基因的篩選對(duì)鑒定到的118個(gè)全長(zhǎng)中國(guó)紅豆杉CYP450序列進(jìn)行了功能注釋。在Blast2Go中,這些CYP450s被劃分為三大類:細(xì)胞組分(cellular component)、生物過程(biological process)與分子功能(molecular function),又具體分為21個(gè)功能組。將這118個(gè)CYP450s序列提交至Swissport,Nt,Nr,COG,GO,KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中,使用BLASTX程序進(jìn)行比對(duì),閾值設(shè)為E1e~(-5)。結(jié)果表明,絕大多數(shù)CYP450s都得到了注釋,其中有15個(gè)新的CYP725家族基因(從CYP725A9至CYP725A23)被注釋到與紫杉醇生物合成相關(guān)。對(duì)中國(guó)紅豆杉CYP450s的表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn),注釋得到的15個(gè)新的CYP725家族基因中,TcCYP725A9,TcCYP725A11,TcCYP725A16,TcCYP725A20,TcCYP725A22和TcCYP725A23這6個(gè)基因的表達(dá)規(guī)律與已知紫杉醇合成羥化酶基因的表達(dá)規(guī)律一致且與紫杉醇合成量呈正相關(guān),是最可能的與紫杉醇生物合成相關(guān)的候選羥化酶基因。3)中國(guó)紅豆杉TcCYP725A22和TcCYP725A23的克隆與酵母異源表達(dá)功能研究選取兩個(gè)候選羥化酶基因TcCYP725A22和TcCYP725A23進(jìn)行克隆,同時(shí)克隆了已知的紫杉烷C2位羥化酶基因T2αH作為陽(yáng)性對(duì)照。選用高拷貝、誘導(dǎo)型釀酒酵母表達(dá)載體pESC-TRP將這三個(gè)基因分別在WAT11中異源表達(dá),Western blot結(jié)果表明,這幾個(gè)目的蛋白均成功表達(dá)。為了鑒定出紫杉醇母核上未知的羥化酶,以具有多個(gè)潛在羥化位點(diǎn)的紫杉素作為底物,與C2位羥化酶T2αH、候選羥化酶TcCYP725A22和TcCYP725A23分別進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)結(jié)果表明,T2αH可以對(duì)紫杉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。候選羥化酶TcCYP725A22對(duì)底物紫杉素表現(xiàn)出催化活性,依據(jù)質(zhì)譜結(jié)果及反應(yīng)底物紫杉素的分子結(jié)構(gòu),判斷催化產(chǎn)物很有可能為添加了兩個(gè)羥基的紫杉烷新衍生物,而TcCYP725A23對(duì)紫杉素未見有明顯的催化活性。4)TcCYP725A22在中國(guó)紅豆杉細(xì)胞體內(nèi)的功能研究鑒于體外反應(yīng)進(jìn)行羥化酶功能探究體系中的紫杉烷底物難以獲得,將具有潛在羥化功能的候選基因TcCYP725A22在中國(guó)紅豆杉細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá),分析轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中紫杉烷類代謝物指紋圖譜的變化情況,確定候選羥化酶基因的催化位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)TcCYP725A22基因過表達(dá)時(shí),幾個(gè)已知的紫杉醇合成相關(guān)的酶基因表達(dá)量也都有不同程度的上調(diào);且細(xì)胞中各紫杉烷的含量普遍提高,其中H3T;decinnamoyl taxinine J;TC和TPT這4種物質(zhì)的含量變化最為顯著。綜合分析這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及酵母異源表達(dá)體外反應(yīng)結(jié)果,可以判斷TcCYP725A22最可能是一個(gè)新的C2位羥化酶基因。以上研究為進(jìn)一步確定紫杉醇生物合成路徑中的未知羥化酶奠定了基礎(chǔ),有助于完全解析紫杉醇生源途徑,促進(jìn)紫杉醇合成生物學(xué)技術(shù)的全面創(chuàng)立。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S791.49
【圖文】：

450 這個(gè)名詞來(lái)描述這類有色物質(zhì)[3, 4]。事實(shí)上有催化功能的血紅蛋白酶，該類蛋白中所含的形成血紅素（heme），使得蛋白呈現(xiàn)紅色。國(guó)際胞色素”來(lái)命名，但是“細(xì)胞色素 P450”這一俗導(dǎo)致很多不便之處[5, 6]。蛋白的催化功能具有底物選擇性，屬于一類 b 型鐵-原卟啉Ⅸ）[7]。在 CYP450 蛋白的空間結(jié)構(gòu)其中的鐵原子可以以氧化型（Fe3+）和還原型YP450 參與電子的傳遞過程。當(dāng)原葉琳鐵以 Fe吸收峰在 416 nm 處，在還原型（Fe2+）細(xì)胞色素 416 nm 處的峰將消失，而在 450 nm 處出現(xiàn)一白變性失活時(shí)，CO 差光譜得到的最大吸收峰不 CYP450 就變?yōu)?CYP420。

還原反應(yīng)0 的催化循環(huán)中，第一個(gè)電子的傳遞是非常快速的[15]。電 和 FMN 的還原酶，再傳遞到 CYP450。在許多細(xì)菌和要鐵硫蛋白的參與，即電子從 NAD( P) H 傳遞到還原酶遞到 CYP450。合YP450 結(jié)合并發(fā)生第一次還原作用后，接下來(lái)是分子氧快的結(jié)合，產(chǎn)生氧化亞鐵復(fù)合體，并自動(dòng)形成超氧化物分子氧[16]。還原反應(yīng)氧化 CYP450-底物復(fù)合體分解。細(xì)胞色素 b5 傳遞第二上，雙氧鍵伸延變?nèi)�，最終裂解，一個(gè)氧原子進(jìn)入底后形成 H2O。CYP450 釋放后將催化下一次循環(huán)反應(yīng)[17

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文（圖 1-4）。肉桂酸-4-羥化酶（C4H）是催化該途徑第 2 步反，已在菊芋、綠豆等植物中被克隆出并得以功能鑒定[46, 47]。酸有著嚴(yán)格的專一性，且該酶在植物的各不同組織中都有著時(shí)，它參與的都是產(chǎn)生重要物質(zhì)（如黃酮、呋喃香豆素、木故得以廣泛關(guān)注。丙烷代謝途徑的一個(gè)主要旁路是合成花色素苷。類黃酮 3’羥5’羥化酶（F3’5’H）催化底物生成類黃酮，兩者在不同植物中花色不同[48-51]。凡是缺少 F3’5’H 的植物，都無(wú)法開出藍(lán)色花）羥化底物 4-香豆�；o酶 A 形成四羥基查耳酮。此外，異異黃酮 3’-羥化酶（I3’H）也已有報(bào)道[53]。 研究者在大丁草長(zhǎng) cDNA，在酵母中異源表達(dá)可以羥基化黃烷酮得到黃酮[54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2783349