【摘要】：紫杉醇是臨床上廣泛使用的抗癌藥物,主要從紅豆杉植物中提取獲得,但天然提取得到的紫杉醇遠不能滿足臨床需求,尋求新的紫杉醇藥源途徑迫在眉睫,發(fā)展合成生物學技術是解決紫杉醇供需矛盾的重要途徑。目前,紫杉醇生源路徑中大部分酶的基因已被確認,但尚有母核上較多細胞色素P450羥化酶基因及其功能未被確認,尤其是母核上C1、C4和C9位對應的細胞色素P450羥化酶基因尚未發(fā)現(xiàn),這是目前研究紫杉醇合成生物學技術的熱點和難點。本課題基于中國紅豆杉轉錄組數(shù)據(jù),對紅豆杉CYP450基因進行系統(tǒng)鑒定,通過功能注釋及表達差異分析,挖掘紫杉醇生物合成相關的新的羥化酶候選基因,并通過基因克隆及功能研究進行候選基因的確認。取得的主要研究結果如下:1)中國紅豆杉CYP450基因的系統(tǒng)鑒定基于中國紅豆杉轉錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)了118個全長和175個非全長的中國紅豆杉CYP450基因。其中,除了5個基因(TcCYP725A1,TcCYP725A2,TcCYP725A4,TcCYP725A5,TcCYP725A6)被報道,以及另一個TcCYP725A3與已知的東北紅豆杉的CYP725A3同源性達99%外,絕大多數(shù)CYP450基因都由本文首次發(fā)現(xiàn)。獲得的118個中國紅豆杉全長CYP450經(jīng)國際標準化分類和命名,被分為8個聚類(clan)和29個家族,同時被分為兩個類別:A-type和non-A-type。其中,52個基因(44.1%)屬于A-type(71 clan),歸屬于11個家族,剩下的66個基因(55.9%)為non-A-type,分屬于18個家族和7個clan。其中,在non-A-type中還發(fā)現(xiàn)兩個新的CYP450家族,即CYP864和CYP947。進化分析表明,中國紅豆杉CYP450的遺傳組成與裸子植物云杉較為一致,而與被子植物擬南芥、苜蓿等有較大差異。中國紅豆杉CYP450s雖然高度分化成多個家族,但仍然有著結構上的保守特征,包括PFG element,PERF motif,K-helix region和I-helix region。2)紫杉醇生物合成相關CYP450羥化酶候選基因的篩選對鑒定到的118個全長中國紅豆杉CYP450序列進行了功能注釋。在Blast2Go中,這些CYP450s被劃分為三大類:細胞組分(cellular component)、生物過程(biological process)與分子功能(molecular function),又具體分為21個功能組。將這118個CYP450s序列提交至Swissport,Nt,Nr,COG,GO,KEGG數(shù)據(jù)庫中,使用BLASTX程序進行比對,閾值設為E1e~(-5)。結果表明,絕大多數(shù)CYP450s都得到了注釋,其中有15個新的CYP725家族基因(從CYP725A9至CYP725A23)被注釋到與紫杉醇生物合成相關。對中國紅豆杉CYP450s的表達差異分析發(fā)現(xiàn),注釋得到的15個新的CYP725家族基因中,TcCYP725A9,TcCYP725A11,TcCYP725A16,TcCYP725A20,TcCYP725A22和TcCYP725A23這6個基因的表達規(guī)律與已知紫杉醇合成羥化酶基因的表達規(guī)律一致且與紫杉醇合成量呈正相關,是最可能的與紫杉醇生物合成相關的候選羥化酶基因。3)中國紅豆杉TcCYP725A22和TcCYP725A23的克隆與酵母異源表達功能研究選取兩個候選羥化酶基因TcCYP725A22和TcCYP725A23進行克隆,同時克隆了已知的紫杉烷C2位羥化酶基因T2αH作為陽性對照。選用高拷貝、誘導型釀酒酵母表達載體pESC-TRP將這三個基因分別在WAT11中異源表達,Western blot結果表明,這幾個目的蛋白均成功表達。為了鑒定出紫杉醇母核上未知的羥化酶,以具有多個潛在羥化位點的紫杉素作為底物,與C2位羥化酶T2αH、候選羥化酶TcCYP725A22和TcCYP725A23分別進行反應。反應產(chǎn)物的HPLC檢測結果表明,T2αH可以對紫杉素進行轉化,結果與文獻報道一致。候選羥化酶TcCYP725A22對底物紫杉素表現(xiàn)出催化活性,依據(jù)質譜結果及反應底物紫杉素的分子結構,判斷催化產(chǎn)物很有可能為添加了兩個羥基的紫杉烷新衍生物,而TcCYP725A23對紫杉素未見有明顯的催化活性。4)TcCYP725A22在中國紅豆杉細胞體內的功能研究鑒于體外反應進行羥化酶功能探究體系中的紫杉烷底物難以獲得,將具有潛在羥化功能的候選基因TcCYP725A22在中國紅豆杉細胞中進行過表達,分析轉基因細胞中紫杉烷類代謝物指紋圖譜的變化情況,確定候選羥化酶基因的催化位點。結果發(fā)現(xiàn),當TcCYP725A22基因過表達時,幾個已知的紫杉醇合成相關的酶基因表達量也都有不同程度的上調;且細胞中各紫杉烷的含量普遍提高,其中H3T;decinnamoyl taxinine J;TC和TPT這4種物質的含量變化最為顯著。綜合分析這些物質的結構特點及酵母異源表達體外反應結果,可以判斷TcCYP725A22最可能是一個新的C2位羥化酶基因。以上研究為進一步確定紫杉醇生物合成路徑中的未知羥化酶奠定了基礎,有助于完全解析紫杉醇生源途徑,促進紫杉醇合成生物學技術的全面創(chuàng)立。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S791.49
【圖文】：

450 這個名詞來描述這類有色物質[3, 4]。事實上有催化功能的血紅蛋白酶，該類蛋白中所含的形成血紅素（heme），使得蛋白呈現(xiàn)紅色。國際胞色素”來命名，但是“細胞色素 P450”這一俗導致很多不便之處[5, 6]。蛋白的催化功能具有底物選擇性，屬于一類 b 型鐵-原卟啉Ⅸ）[7]。在 CYP450 蛋白的空間結構其中的鐵原子可以以氧化型（Fe3+）和還原型YP450 參與電子的傳遞過程。當原葉琳鐵以 Fe吸收峰在 416 nm 處，在還原型（Fe2+）細胞色素 416 nm 處的峰將消失，而在 450 nm 處出現(xiàn)一白變性失活時，CO 差光譜得到的最大吸收峰不 CYP450 就變?yōu)?CYP420。

還原反應0 的催化循環(huán)中，第一個電子的傳遞是非�？焖俚腫15]。電 和 FMN 的還原酶，再傳遞到 CYP450。在許多細菌和要鐵硫蛋白的參與，即電子從 NAD( P) H 傳遞到還原酶遞到 CYP450。合YP450 結合并發(fā)生第一次還原作用后，接下來是分子氧快的結合，產(chǎn)生氧化亞鐵復合體，并自動形成超氧化物分子氧[16]。還原反應氧化 CYP450-底物復合體分解。細胞色素 b5 傳遞第二上，雙氧鍵伸延變弱，最終裂解，一個氧原子進入底后形成 H2O。CYP450 釋放后將催化下一次循環(huán)反應[17

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文（圖 1-4）。肉桂酸-4-羥化酶（C4H）是催化該途徑第 2 步反，已在菊芋、綠豆等植物中被克隆出并得以功能鑒定[46, 47]。酸有著嚴格的專一性，且該酶在植物的各不同組織中都有著時，它參與的都是產(chǎn)生重要物質（如黃酮、呋喃香豆素、木故得以廣泛關注。丙烷代謝途徑的一個主要旁路是合成花色素苷。類黃酮 3’羥5’羥化酶（F3’5’H）催化底物生成類黃酮，兩者在不同植物中花色不同[48-51]。凡是缺少 F3’5’H 的植物，都無法開出藍色花）羥化底物 4-香豆酰基輔酶 A 形成四羥基查耳酮。此外，異異黃酮 3’-羥化酶（I3’H）也已有報道[53]。 研究者在大丁草長 cDNA，在酵母中異源表達可以羥基化黃烷酮得到黃酮[54

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王紀明;劉煒;徐鑫;張海波;咸漠;;工程大腸桿菌生產(chǎn)高附加值有機酸、醇研究進展[J];生物工程學報;2013年10期

2 岳桂東;高強;羅龍海;王軍一;許姣卉;尹燁;;高通量測序技術在動植物研究領域中的應用[J];中國科學:生命科學;2012年02期

3 牛云云;羅紅梅;黃林芳;陳士林;何順志;;細胞色素P450在人參皂苷生物合成途徑中的研究進展[J];世界科學技術(中醫(yī)藥現(xiàn)代化);2012年01期

4 李向陽;張嘉保;任文郅;劉殿峰;;酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質相互作用中的應用[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;2011年01期

5 李瀅;孫超;羅紅梅;李西文;牛云云;陳士林;;基于高通量測序454 GS FLX的丹參轉錄組學研究[J];藥學學報;2010年04期

6 張長波;孫紅霞;鞏中軍;祝增榮;;植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關合酶[J];植物生理學通訊;2007年04期

7 華梓婷;郭養(yǎng)浩;孟春;劉曉楠;;細胞色素P450的基因多態(tài)性與藥物代謝[J];中國新藥雜志;2007年07期

8 王偉,孟超,朱平,程克棣;代謝工程酵母菌合成紫杉烯的研究[J];中國生物工程雜志;2005年08期

9 朱立勤,婁建石;細胞色素P450與藥物代謝的研究現(xiàn)狀[J];中國臨床藥理學與治療學;2004年10期

10 邱星輝,冷欣夫;棉鈴蟲幼蟲加單氧酶活性的組織分布[J];生態(tài)學報;2000年02期

本文編號：2783349