【摘要】：本研究根據(jù)課題組前期從葡萄風信子‘亞美尼亞’中克隆到的MaDFR2b序列,構(gòu)建原核表達載體pET-28a(+)-MaDFR2b、pMAL-c5x-MaDFR2b,在不同誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間條件下誘導(dǎo)融合蛋白表達,用SDS-PAGE檢測重組融合蛋白MaDFR2b的表達情況,選出可溶融合蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)條件。獲得的可溶重組融合蛋白經(jīng)親和層析法純化后,進行體外酶促反應(yīng)鑒定其活性。取得結(jié)果如下:1.用原核表達的方法體外誘導(dǎo)葡萄風信子MaDFR2b蛋白表達,結(jié)果表明在大腸桿菌表達系統(tǒng)中,28℃、IPTG濃度0.5mM,誘導(dǎo)6小時時能高效誘導(dǎo)出可溶性的MaDFR2b融合蛋白。采用親和層析法對目的蛋白進行純化,經(jīng)SDS-PAGE檢測和Quantity-one分析可知,其純度達90%,純化的MaDFR2b融合蛋白達到了符合后續(xù)實驗要求的純度。2.獲得的目的蛋白以二氫黃酮醇為底物進行體外酶促反應(yīng)實驗,高效液相色譜結(jié)果顯示,葡萄風信子MaDFR2b能催化二氫槲皮素和二氫楊梅素,但是不能催化二氫山奈酚。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化實驗:構(gòu)建MaDFR2b過量表達載體,通過農(nóng)桿菌注射法瞬時轉(zhuǎn)化月季‘蘇醒’,結(jié)果顯示,攜帶功能基因的過表達載體侵染的月季花瓣出現(xiàn)藍色斑塊。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S682.29
【圖文】：

酶促反應(yīng)體系如下（李厚華）：100mM Tris-HCL (PH=7.5) 370μl,10μl,10μg/μl 二氫黃酮醇 10μl,純化蛋白 20μg,用 ddH2O 補齊至 500育 4h 后，反應(yīng)物用 500 uL 乙酸乙酯終止反應(yīng)，于 50℃烘箱烘干，用萃取液：甲酸：三氟乙酸=2:7:2:1）萃取 2 次(Zhang et al., 2012; 韓振云 et al.心后上清用 0.22μm 微孔濾膜過濾，并通過 HPLC 檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物。高效液相色譜反應(yīng)條件為：流速 0.8ml/min，流動相 A 相為 0.1%甲酸，B腈。洗脫程序為：0min，12%B；15min，25%B；32min，38%B；40min5min，12%B；50min，12%B。紫外檢測吸收波長為 530nm 和 340nm（王琳 等.3 結(jié)果與分析.3.1 原核表達載體 pET-28a（+）-MaDFR2b、pMAL-c5x-MaDFR2b 的構(gòu)建以獲得的 pMD 19-T-MaDFR2b 質(zhì)粒為模板，通過 PCR 擴增獲得了與目一致的 MaDFR2b 片段（約 1100bp）（圖 2-1）。將 MaDFR2b 和載體雙酶切到 pET-28a（+）和 pMAL-c5x 原核表達載體上，得到重組質(zhì)粒（圖 2-2）。測序，經(jīng) Blast 序列比對，測序結(jié)果與 MaDFR2b 基因序列一致。

原核表達載體pET-28a(+)示意圖

圖 2-2 原核表達載體 pET-28a(+)示意圖Schematic of Prokaryotic Expression Vector pET-28a(+)

【參考文獻】

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本文編號：2781113