【摘要】：雙組份信號系統(tǒng)是細(xì)菌中最常見的信號傳導(dǎo)系統(tǒng),能夠感應(yīng)、傳導(dǎo)外界環(huán)境刺激,調(diào)節(jié)菌體內(nèi)對應(yīng)的基因適應(yīng)性表達(dá),在細(xì)菌抵抗不良環(huán)境的過程中發(fā)揮著重要的作用。Cupriavidus gilardii CR3是典型的重金屬抗性基因位于染色體上的細(xì)菌,對銅的最小抑菌濃度(MIC)是3 mM。以往研究表明貪銅菌Cupriavidus metallidurans CH34、Cupriavidus necator N-1、Cupriavidus taiwanensis LMG 19424的雙組份信號傳導(dǎo)系統(tǒng)豐富多樣、功能強(qiáng)大且參與重金屬抗性調(diào)控機(jī)制。目前,關(guān)于C.gilardii CR3的雙組份信號系統(tǒng)的研究尚無報道。本文首次研究了C.gilardii CR3全基因組的雙組份信號系統(tǒng)分布特征,克隆鑒定了銅抗性雙組份信號基因(copSR),運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR測定了不同銅離子濃度脅迫下copSR及其調(diào)控的結(jié)構(gòu)基因(copB)在mRNA水平上的差異表達(dá)情況。此外,通過生物信息學(xué)技術(shù)對雙組份蛋白CopSR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析、功能預(yù)測和KEGG代謝通路分析�；谏鲜鲅芯�,本文分析了貪銅菌復(fù)雜多樣的信號傳導(dǎo)機(jī)制,揭示了C.gilardii CR3銅抗性調(diào)控機(jī)制。本文研究結(jié)果可為C.gilardii CR3在銅污染水體和土壤修復(fù)的潛在應(yīng)用提供重要的理論參考。主要研究結(jié)果如下:(1)通過比較基因組學(xué)分析,結(jié)果表明C.gilardii CR3全基因組共有96個基因編碼雙組份信號蛋白,組成了22個雙組份信號系統(tǒng),其中與銅抗性相關(guān)的雙組份信號系統(tǒng)比例最大。C.gilardii CR3的雙組份信號系統(tǒng)與同屬C.metallidurans CH34、C.necator N-1、C.taiwanensis LMG 19424擁有10個相同的HK蛋白功能域和7個相同的RR蛋白功能域,維持貪銅菌間的保守特性。此外,C.gilardii CR3含有4個HK特有蛋白功能域和1個RR特有蛋白功能域,特異性地適應(yīng)C.gilardii CR3的生存環(huán)境。(2)克隆結(jié)果表明雙組份信號系統(tǒng)編碼基因copSR確實(shí)存在于C.gilardii CR3中。測序及NCBI序列比對結(jié)果表明,C.gilardii CR3中的copSR基因序列與標(biāo)準(zhǔn)copSR基因序列完全相同,copS為1404 bp,copR為687 bp。Smart數(shù)據(jù)庫分析表明,copS編碼的蛋白CopS為C.gilardii CR3的雙組份感應(yīng)蛋白CopS(WP_053820945.1),copR編碼的蛋白CopR為C.gilardii CR3的雙組份反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CopR(NP_251499.1)。菌株CR3的CopS蛋白與Cupriavidus sp.HPC(L)的感應(yīng)傳導(dǎo)激酶同源性較高,菌株CR3的CopR蛋白與Cupriavidus sp.HPC(L)的調(diào)控因子同源性較高。(3)通過實(shí)時熒光定量PCR研究C.gilardii CR3在Cu2+刺激下目標(biāo)基因copSRB的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明,C.gilardii CR3在0.5 mM、1 mM、2 mM Cu2+脅迫2 h后,copSR表達(dá)量上調(diào),且隨著銅離子濃度增加而顯著升高(P0.001),2 mM達(dá)到最大。C.gilardii CR3在不同濃度Cu2+脅迫下,各生長階段的基因表達(dá)規(guī)律不盡相同。在0.5mM Cu2+脅迫下,copSR基因表達(dá)量在7 h(對數(shù)生長早期)達(dá)到最大;1 mM Cu2+脅迫時下copSR基因表達(dá)量在4 h(遲緩生長晚期)達(dá)到最大;2 mM Cu2+作用下copSR在2 h(遲緩生長早期)表達(dá)量達(dá)到最大。即銅離子濃度越高,copSR達(dá)到最大表達(dá)量的時間越短。copB的表達(dá)受copSR調(diào)控,與copSR表達(dá)趨勢一致。(4)生物信息學(xué)分析表明,C.gilardii CR3的CopS為跨膜組氨酸激酶,具有功能域HATPase_c、HisKA和HAMP信號域,第255位氨基酸殘基為保守的組氨酸殘基,發(fā)生自磷酸化反應(yīng)。C.gilardii CR3的Cop R為胞質(zhì)調(diào)控蛋白,具有功能域REC和trans_reg_C,第51位為天冬氨酸殘基,接收來自CopS的磷酸基團(tuán)。C.gilardii CR3的CopS三級結(jié)構(gòu)與Thermotoga maritima的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白DrrD結(jié)構(gòu)相似,CopR蛋白三級結(jié)構(gòu)與Caulobacter crescentus的組氨酸激酶DivL結(jié)構(gòu)相似。綜上,C.gilardii CR3含有豐富多樣的雙組份信號系統(tǒng),C.gilardii CR3中的copSR為銅抗性雙組份信號系統(tǒng)。銅抗性雙組份蛋白CopS和CopR共同感應(yīng)和傳導(dǎo)C.gilardii CR3外界環(huán)境中銅離子刺激,調(diào)控下游銅抗性結(jié)構(gòu)基因表達(dá),維持菌體胞內(nèi)銅離子平衡,對C.gilardii CR3抵抗外界環(huán)境中的銅離子威脅起到至關(guān)重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78
【圖文】：

nas syringae 的 cop 系統(tǒng)模型圖（CM:質(zhì)膜；PS:周質(zhì)空間；OM:外l of cop system in Pseudomonas syringae (CM: cytoplasmic membranspace; OM：outermembrane This figure is from [27])

第三章 銅抗性雙組份信號基因 copSR 的克隆和序列分析.1 引言在第二章 C. gilardii CR3 的全基因組雙組份信號系統(tǒng)分析中，我們發(fā)現(xiàn) C. gilarR3 中銅抗性相關(guān)的雙組份信號系統(tǒng)基因（copSR）所占比例最大，為 C. gilardii C銅抗性提供生物信息學(xué)依據(jù)。copSR 基因在 C. gilardii CR3 中的分布情況如圖 3-1（信息來自 NCBI）。copS(1404bp)和 copR(687bp)相鄰，轉(zhuǎn)錄方向相同，與結(jié)構(gòu)基copABCD 等）轉(zhuǎn)錄方向相反。本章以 copSR 基因?yàn)檠芯繉ο�，�?C. gilardii CR3 copSR 進(jìn)行克隆及序列分析，以期為第二章的基因組分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為后續(xù)奠定基礎(chǔ)。

圖 3-2 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖 圖 3-3 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig. 3-2 Electrophoresis analysis of DNA Fig. 3-3 Electrophoresis analysis o3.3.2 克隆子鑒定包含目的片段copSR的單克隆子菌落(分別挑取6個陽性單菌落)的P泳結(jié)果如圖 3-4 所示。所挑取的六個單菌落 PCR 產(chǎn)物電泳條帶清晰。M2 1 2 3 4 5 6 M2M2：DL2000 DNA1：單菌落-12：單菌落-23：單菌落-34：單菌落-45：單菌落-56：單菌落-6

【參考文獻(xiàn)】

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1 單世平;郭照輝;張德元;劉清術(shù);程偉;黃軍;魏小武;王玉雙;伍善東;付祖姣;;貪銅菌6-5雙組分信號系統(tǒng)czcR2-czcS2的克隆和生物信息學(xué)分析[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2014年36期

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1 馬占強(qiáng);苜蓿中華根瘤菌CCNWSX0020抗銅基因的克隆與功能驗(yàn)證[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

本文編號：2780956