發(fā)布時間：2020-07-24 20:37

【摘要】：本文以丹參無菌苗葉片為外植體,采用組織培養(yǎng)技術(shù)研究了植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA對丹參葉片的誘導(dǎo)分化,建立了丹參的高效再生體系,以此為基礎(chǔ),利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了丹參葉片分化過程中丹酚酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因表達和不定芽分化關(guān)系。建立了丹參葉片農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究為揭示丹參器官分化與丹酚酸生物合成之間的關(guān)系及利用超表達和抑制表達研究丹酚酸生物合成相關(guān)基因功能奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果包括:1.丹參高效再生體系的建立:以丹參無菌苗葉片為外植體,接種于附加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA,NAA的MS基本培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)單獨使用6-BA或NAA幾乎無愈傷組織和叢生芽的分化,組合使用兩種外源激素能獲得分化狀態(tài)好的愈傷組織,愈傷組織誘導(dǎo)率為100%,不定芽分化率為14%-87%;過高濃度的6-BA會抑制愈傷組織的誘導(dǎo),高濃度的NAA會使愈傷組織褐化,最佳的激素配比為:MS+6-BA3.0mg·L~(-1)+NAA0.2mg·L~(-1),愈傷組織誘導(dǎo)率可達到100%,不定芽的分化率可達到80%;1/2MS+NAA0.1mg·L~(-1)為最佳生根培養(yǎng)基,根誘導(dǎo)率為100%。2.研究了不同分化狀態(tài)的丹參組織中生理生化指標(biāo)變化。測定了葉片、分化愈傷組織和難分化愈傷組織中脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和苯丙氨酸解氨酶活性等,發(fā)現(xiàn)在難分化愈傷組織中脯氨酸和可溶性糖含量最高,葉片最低;苯丙氨酸解氨酶活性難分化愈傷組織最高;葉片中可溶性蛋白含量最高。3.分析了不同分化狀態(tài)的丹參組織與丹酚酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因表達量之間的關(guān)系。測定了丹參分化芽的愈傷組織和難分化愈傷組織中不同階段丹酚酸生物合成關(guān)鍵酶基因的相對表達量,發(fā)現(xiàn)Sm4cl、Smhppr在分化芽和未分化愈傷組織中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;Smc4h呈現(xiàn)不斷下降的趨勢;在培養(yǎng)23 d時,分化芽愈傷組織Smhppr表達量比難分化愈傷組織高13%,在7、15和23 d時,Sm4cl分別高75%、32%和86%;Smc4h分別高61%、47%和40%。結(jié)合前期試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在難以分化愈傷組織分化生長過程中丹酚酸的積累量少,而在分化芽愈傷組織中丹酚酸積累量升高,說明丹酚酸含量與3個基因的表達密切相關(guān)。3個基因在根、莖、葉的表達量均高于花序。Smc4h分別高85%、81%和80%;Sm4cl分別高87%、84%和82%;Smhppr分別高74%、79%和18%。4.以gfp基因作為外源標(biāo)記基因,建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化率最高可達40%。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.53
【圖文】：

表 2 不同濃度 NAA 對丹參不定芽生根的影響Tab.2 Effects of different concentrations of NAAon rooting of Salvia miltiorrhiza激素濃度/mg·L-1Hormone concentration生根時間/dThe time ofroot/d根誘導(dǎo)率/%Rootinductionrate/%株高/cmPlant height/cm根長/cmRoot length/cm生長勢The growthpotential1/2MS 23 38±7.46c 7.80±0.73a 4.93±1.01ab ＋1/2MS+0.1 NAA 6 100±0.00ab 8.90±1.78a 6.75±0.72a ＋＋＋1/2MS+0.5NAA 9 100±0.00ab 10.10±1.87a 3.93±0.37bc ＋＋＋1/2MS+1.0 NAA 15 88.9±13.2b 8.72±1.87a 2.38±0.19c ＋＋：+：一般 ++：較好 +++：很好ote:+:common ++:better +++:good而在其根誘導(dǎo)率方面不含激素的培養(yǎng)基中生根率只有 38%，表現(xiàn)為顯著性差異（P<0.05），當(dāng) NAA 濃度 0.1-0.5 mg·L-1時，生根率為 100%，在 NAA 濃度為 0.1-1.0mg·L-的范圍內(nèi)差異不顯著(P>0.05)。

河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文表 3 不同濃度 6-BA 對丹參帶葉腋莖段分化出芽的影響3 The effects of 6-BAconcentration on the differentiation of bud in axillary stem of Salvia miltio養(yǎng)基mediumρ(6-芐基氨基嘌呤)/(mg·L-1)6-Benzylaminopurine出芽時間/dBudding time/d再生芽誘導(dǎo)率/%Regeneration budinduction rate/%再生芽生RegenerationstaS 0.5 4 100 ＋S 1.0 3 100 ＋＋S 1.5 3 100 ＋+：較好 +++：很好 ++:better +++:good丁酸對莖段分化叢生芽有明顯的促進作用；通過比較 6-BA 0.5m 1.5 mg·L-1濃度下培養(yǎng) 10 d 的叢生芽生長狀態(tài)（圖 4）發(fā)現(xiàn)，濃度為

第 2 章 丹參高效組織培養(yǎng)體系的建立2.5.1.6 再生植株的馴化與移栽 將在罐頭瓶中培養(yǎng) 30 d 的根系發(fā)達莖稈粗壯的丹參植株開口放于植物培養(yǎng)室中適應(yīng) 2-3 d，后洗去植株根部的培養(yǎng)基栽種于營養(yǎng)土:砂土:黏土:蛭石=1:1:1:1 的滅菌基質(zhì)中，給與穩(wěn)定的培養(yǎng)條件使之生長。

【參考文獻】

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本文編號：2769362