【摘要】：蓮藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物,原產(chǎn)于中國(guó)和印度,現(xiàn)于東南亞、日本及中國(guó)均有栽培。蓮藕是我國(guó)種植面積最大的水生蔬菜,其產(chǎn)品包括鮮藕、蓮籽和藕粉,含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)及多種維生素,具有較好的保健功能,深受大眾消費(fèi)者的喜愛。目前蓮藕栽培種對(duì)鹽敏感,而耐鹽品種存在于野生資源中。隨著我國(guó)土壤鹽漬化范圍及沿海灘涂面積不斷擴(kuò)大,培育蓮藕耐鹽新品種,使其在含鹽量較高的鹽漬化土壤中栽培,既有利于提高土地利用率,同時(shí)又改善了當(dāng)?shù)丨h(huán)境。質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PlasmaMembrane InstrinsicProtein,PIP)是目前研究較多的水通道蛋白中的一種,研究表明PIP具有提高植物耐鹽性的作用[1]。由于受細(xì)胞膜的限制,PIP可能通過介導(dǎo)葉和根中水分的跨細(xì)胞運(yùn)輸來提高植物的耐鹽能力。因此,本研究從耐鹽野生蓮中克隆了PIP家族基因,并研究了其在逆境脅迫下的表達(dá)特征,同時(shí)對(duì)鹽誘導(dǎo)的基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1和NnPIP2-7)進(jìn)行了過表達(dá)載體的構(gòu)建,結(jié)果如下:1、采用RT-PCR技術(shù),從野生耐鹽蓮藕資源H5中克隆得到8個(gè)PIP家族基因,基因核苷酸全長(zhǎng)在843 bp-864 bp之間。通過對(duì)比NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),我們發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)得到的蓮藕PIP家族基因和擬南芥、水稻和玉米PIP家族基因的同源性較高,家族基因之間的同源性在67%-90%,因此把本實(shí)驗(yàn)克隆的基因命名為NnPIPs。進(jìn)一步研究表明NnPIP1與AtPIP1和NnPIP2與AtPIP2之間的同源性要高于NnPIP1與NnPIP2之間的同源性,表明NnPIP1和NnPIP2屬于同一基因家族中的2個(gè)亞類。在基因結(jié)構(gòu)上,NnPIPs中每個(gè)成員都具有6個(gè)α-跨膜螺旋和5個(gè)相連接的環(huán)(A環(huán)-E環(huán)),且B環(huán)和E環(huán)上均有一個(gè)NPA(Asn-Pro-Ala)結(jié)構(gòu)域,這是植物體運(yùn)輸水和CO2等一些小分子的基本結(jié)構(gòu)。2、利用半定量RT-PCR及qRT-PCR技術(shù),以β-actin為內(nèi)參,分別在NaCl、甘露醇、ABA、低溫和PEG處理0 h、6 h、12 h、18 h、24 h研究了NnPIPs在蓮藕H5中的表達(dá)特性。結(jié)果表明:在250 mMNaCl處理下,NnPIP1-2的表達(dá)量在0-24 h呈上調(diào)趨勢(shì),處理24 h達(dá)到最高,NnPIP2-和NnPIP2-7的表達(dá)量在0-12 h呈上調(diào)趨勢(shì),12 h后達(dá)到最高,NnPIP1-3和NnPIP1-4的表達(dá)量在NaCl處理后下降,NnPIP1-1和NnPIP2-8在處理的時(shí)間內(nèi)不受鹽誘導(dǎo),表達(dá)量無顯著改變;在200mM甘露醇處理下,NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP1-4、NnPIP2-1和NnPIP2-7的表達(dá)量均無顯著改變,NnPIP2-8的表達(dá)量在處理12h后顯著增加,18h表達(dá)量達(dá)到最大值;在50μMABA處理下,NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnIP2-8的表達(dá)量在ABA處理后6 h至18 h期間呈不同程度的增加,NnPIP1-1、NnPIP1-2和NnPIP1-4的表達(dá)量在處理時(shí)間內(nèi)無顯著變化;在低溫(4℃)處理下,NnPIP1-1和NnPIP2-7的表達(dá)量在低溫處理后18 h達(dá)到最大,NnPIP1-2、NnPIP1-3和NnPIP2-8的表達(dá)量在處理24 h內(nèi)無顯著變化,NnPIP1-4和NnPIP2-1的表達(dá)量在0-24 h內(nèi)呈下降趨勢(shì);利用10%PEG6000處理蓮藕幼苗24h,發(fā)現(xiàn)NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnPIP2-8 的表達(dá)量在 24 h 內(nèi)顯著增加,而NnPIP1-4的表達(dá)量先下降,然后上升。以上數(shù)據(jù)表明,NnPIPs在響應(yīng)不同逆境脅迫時(shí),其表達(dá)模式具有多樣性特征。3、本實(shí)驗(yàn)利用pAMBIA 1301過表達(dá)載體對(duì)上述3個(gè)鹽誘導(dǎo)的PIP家族基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1、NnPIP2-7)進(jìn)行了載體構(gòu)建,以便進(jìn)一步研究基因功能。通過雙酶切和PCR鑒定,我們認(rèn)為成功地構(gòu)建了pAMBIA1301-NnPIP1-2、pAMBIA1301-NnPIP2-1和pAMBIA1301-NnPIP2-7 過表達(dá)載體。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S645.1
【圖文】：

基因的研究進(jìn)展逡逑鹽基因的研究較為深入，這些基因主要有氧脅迫相碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因、離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、解旋因逡逑會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，這些活性氧能夠破壞生物膜，統(tǒng)。當(dāng)植物導(dǎo)入解毒酶或調(diào)控氧化脅迫相關(guān)酶基因后定膜結(jié)構(gòu)和蛋白復(fù)合體，細(xì)胞耐脫水能力得到提高。）調(diào)控不同的防御反應(yīng)和發(fā)育途徑，高鹽、重金屬和達(dá)，進(jìn)而提高了植物對(duì)逆境脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力Ｐ］。

逡逑管逡逑圖２．１蓮藕總ＲＮＡ的凝膠電泳圖逡逑Ｍ：分子量標(biāo)記；１－４：樣品ＲＮＡ逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｉｍｍａｔｕｒｅ邋ｌｅａｖｅｓ邋ｏｆ邋ｌｏｔｕｓ邋ｒｏｏｔ逡逑Ｍ：邋ＤＬ邋５０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｌｏｔｕｓ邋ｒｏｏｔ逡逑２．２邐ｃＤＮＡ序列的克隆及分析逡逑２．２．１邐ｃＤＮＡ序列的克隆逡逑對(duì)蓮藕進(jìn)行ｃＤＮＡ全長(zhǎng)克隆，利用１邋％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)ＰＣＲ反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢逡逑測(cè)。結(jié)果如圖２．２所示：ＰＣＲ產(chǎn)物的大小均在８６０ｂｐ左右，與預(yù)期大小一致。測(cè)序后，發(fā)逡逑現(xiàn)目前我們克隆到的ＰＩＰｓ基因的核苷酸數(shù)位于８４３￣８６４ｂｐ，編碼氨基酸殘基數(shù)在２８０？２８７逡逑（表２．２所示）。Ｂｌａｓｔ比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，８?jìng)�(gè)ｉＶ／ｉＰ／作與ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥、玉米和水稻種逡逑的Ｐ／Ａ相似度較高，因此命名為逡逑１０００ｂｐ－＾Ｐ邐＾邋ＭＶ＇邐＾邋ｆ逡逑７５０邋ｂｐ＋＿＿｜＿｜＿＾｜＿｜＿｜｜＿＿灥媝＿｜逡逑圖２．２邐ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖逡逑Ｍ．／六予ｉ標(biāo)記＇邐ＮｎＰＩＰｌ－１，ＮｎＰＩＰｌ－２，邋ＮｎＰＩＰｌ－３，邋ＮｎＰＩＰｌ－４，邋ＮｎＰＩＰ２－ｌ，ＮｎＰＩＰ２－４，邋ＮｒｉＰＩＰ２－７，逡逑ＮｎＰＩＰ２－８逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＮｎＰＩＰｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－８：邋ＮｎＰＩＰｌ－ｌ邋ＮｎＰＩＰｌ－２

邐ｃＤＮＡ序列的克隆逡逑對(duì)蓮藕進(jìn)行ｃＤＮＡ全長(zhǎng)克隆，利用１邋％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)ＰＣＲ反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢逡逑測(cè)。結(jié)果如圖２．２所示：ＰＣＲ產(chǎn)物的大小均在８６０ｂｐ左右，與預(yù)期大小一致。測(cè)序后，發(fā)逡逑現(xiàn)目前我們克隆到的ＰＩＰｓ基因的核苷酸數(shù)位于８４３￣８６４ｂｐ，編碼氨基酸殘基數(shù)在２８０？２８７逡逑（表２．２所示）。Ｂｌａｓｔ比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，８?jìng)�(gè)ｉＶ／ｉＰ／作與ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥、玉米和水稻種逡逑的Ｐ／Ａ相似度較高，因此命名為逡逑１０００ｂｐ－＾Ｐ邐＾邋ＭＶ＇邐＾邋ｆ逡逑７５０邋ｂｐ＋＿＿｜＿｜＿＾｜＿｜＿｜｜＿＿灥媝＿｜逡逑圖２．２邐ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖逡逑Ｍ．／六予ｉ標(biāo)記＇邐ＮｎＰＩＰｌ－１，ＮｎＰＩＰｌ－２，邋ＮｎＰＩＰｌ－３，邋ＮｎＰＩＰｌ－４，邋ＮｎＰＩＰ２－ｌ，ＮｎＰＩＰ２－４，邋ＮｒｉＰＩＰ２－７，逡逑ＮｎＰＩＰ２－８逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＮｎＰＩＰｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－８：邋ＮｎＰＩＰｌ－ｌ邋ＮｎＰＩＰｌ－２，邋ＮｎＰＩＰｌ－３，邋ＮｎＰＩＰｌ－４ｙ邋ＮｎＰＩＰ２－ｌ，邋ＮｎＰＩ

【參考文獻(xiàn)】

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1 李偉;韓嬌;黃升財(cái);何蕊;王冰;程憲國(guó);;小鹽芥TsPIP1;1與TsTIP1;1基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽性[J];植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào);2017年04期

2 季延海;于平彬;武占會(huì);吳震;劉明池;;低濃度NaCl對(duì)水培韭菜生長(zhǎng)、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J];中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2015年05期

3 顏培玲;潘學(xué)軍;張文娥;;野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIP1的克隆及其在干旱脅迫下的表達(dá)分析[J];園藝學(xué)報(bào);2015年02期

4 王貝貝;龔一富;王鈺U

本文編號(hào)：2766396