【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是典型的短日作物,光周期反應(yīng)較為敏感。對(duì)晚熟品種(如自貢冬豆)而言,短日照是其開花和成熟的必要條件,連續(xù)的短日處理會(huì)顯著加快開花和成熟;對(duì)經(jīng)過一定日數(shù)短日誘導(dǎo)、已經(jīng)開始生殖發(fā)育的植株進(jìn)行長(zhǎng)日處理,可以解除短日效應(yīng),使頂端分生組織從生殖器官分化回復(fù)到營(yíng)養(yǎng)器官分化狀態(tài),發(fā)生開花逆轉(zhuǎn)。上述現(xiàn)象說明,在大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中,長(zhǎng)日也有其獨(dú)特的生理效應(yīng),且可能誘導(dǎo)產(chǎn)生某些開花抑制物質(zhì)。Flowering Locus T(FT)是植物開花途徑中的信號(hào)整合基因。在大豆中,已發(fā)現(xiàn)10個(gè)FT同源基因,其中,GmFT2a和GmFT5a是在短日條件下高效表達(dá)的開花促進(jìn)基因,而GmFT4在長(zhǎng)日條件下高效表達(dá),在擬南芥中的異位表達(dá)導(dǎo)致了開花時(shí)間的延遲,說明大豆的FT基因功能可能存在分化,但在大豆FT基因家族中是否存在其它開花抑制基因仍不明確。本研究利用所在實(shí)驗(yàn)室多年研究建立的自貢冬豆開花逆轉(zhuǎn)系統(tǒng),對(duì)大豆中的10個(gè)FT同源基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析,篩選到了3個(gè)在長(zhǎng)日條件下高效表達(dá)的FT基因:GmFT1a、GmFT1b和GmFT4。對(duì)從自貢冬豆中克隆得到的GmFT1a進(jìn)行的系統(tǒng)研究表明,長(zhǎng)日照下該基因在葉片中的表達(dá)量高于短日,且在維管組織中有較高的表達(dá)量。該基因編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。對(duì)不同品種中GmFT1a表達(dá)模式的比較發(fā)現(xiàn),GmFT1a在黑河27等早熟品種中的表達(dá)量較低,而在晚熟品種中的表達(dá)量相對(duì)較高。不論品種光周期敏感性如何,GmFT1a在長(zhǎng)日條件下的表達(dá)量均高于短日條件,與GmFT2a/GmFT5a的表達(dá)模式相反。分別利用E1近等基因系和E1過表達(dá)材料初步研究了GmFT1a表達(dá)量與大豆生育期重要調(diào)控基因E1的關(guān)系。結(jié)果表明,在E1近等基因系中,當(dāng)E1為顯性時(shí),GmFT1a表達(dá)量相對(duì)較高;E1的過表達(dá)使GmFT1a的表達(dá)量上升。通過雙熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn),E1增強(qiáng)了GmFT1a CDS區(qū)上游序列驅(qū)動(dòng)的LUC報(bào)告基因的活性。在該基因本底表達(dá)量較低的中熟品種Jack中過表達(dá)GmFT1a時(shí),GmFT2a的表達(dá)量明顯降低,開花期和成熟期明顯延遲,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的并行期延長(zhǎng),且在短日條件下產(chǎn)生更多的節(jié)數(shù)。對(duì)GmFT1a過表達(dá)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),一系列與開花相關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生變化�；诒狙芯坎⒔Y(jié)合前人研究,提出了調(diào)控大豆生長(zhǎng)發(fā)育的蹺蹺板模型(Teeter board model):大豆FT基因家族存在明顯的功能分化,可分為開花促進(jìn)基因(包括GmFT2a、GmFT5a等)和開花抑制基因(如GmFT1a、GmFT4)兩類,二者通過表達(dá)量的相對(duì)變化影響大豆生長(zhǎng)發(fā)育的方向。綜上所述,大豆FT同源基因存在明顯的功能分化,開花促進(jìn)基因和抑制基因的平衡狀態(tài)決定大豆生長(zhǎng)發(fā)育的方向。GmFT1a的發(fā)現(xiàn)為大豆生育期性狀的調(diào)控提供了新的分子工具。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S565.1
【圖文】：

圖 3.6 大豆和其它物種中已知功能的 FT 氨基酸序列比對(duì)蛋白名稱中：綠色陰影表示開花促進(jìn)基因編碼的蛋白質(zhì)；紅色陰影代表開花抑制基因編碼的蛋白質(zhì)；藍(lán)色框代表External Loop；紅色方框代表 VYN triad；紅色三角形表示 GmFT1a 中可能的差異位點(diǎn)。Figure 3.6: Sequence comparison of known FTs in soybean and other speciesThe protein name with a green or red shadow means it is a flowering-promoting FT or a flowering-inhibiting Frespectively; The blue and red box represent a 14-amino-acid external loop and a 3-amino-acid triad respectively; The retriangles represent the amino acid residues 131, 134 and 135 in GmFT1a which are different from thflowering-promoting FTs in soybean or other species.3.3.2 GmFT1a 的亞細(xì)胞定位3.3.2.1 融合表達(dá)載體 p16318-GmFT1a 的構(gòu)建根據(jù)含有 XbaI, SacI 酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增得到含有該酶切位點(diǎn)，且不含終止密碼子的GmFT1a 產(chǎn)物，連接 PLB 載體后，通過菌液 PCR 篩選陽性轉(zhuǎn)化子測(cè)序。提取原始質(zhì)粒 p16318 和PLB-GmFT1a，并將二者分別進(jìn)行 XbaI、SacI 雙酶切（圖 3.7 A, B），電泳檢測(cè)后回收 p16318 載

獲得了根部過量表達(dá) GmFT1a 的復(fù)合體植株（圖4.12），將子葉節(jié)下的主根剪下后，將其與對(duì)照組植株共同在短日條件下培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖 4.12 復(fù)合體植株的獲得A：子葉節(jié)注射；B：子葉節(jié)處出現(xiàn)瘤狀突起； C：子葉節(jié)處長(zhǎng)出發(fā)狀根后將主根剪去。Figure 4.12 Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformationA: The unfolded cotyledons were injected with K599 strain containing 35S::GmFT1a by stabbing at their cotyledonarynode several times with a syringe needle. B: The nodular texture emerging at the stabbing position. C: Removing themain roots after the hairy-roots emergence.4.3.4.2 根部過量表達(dá) GmFT1a 對(duì)植株開花和成熟的影響在植株培養(yǎng)的過程中，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中部分材料的開花有所延遲，對(duì)所有植株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，當(dāng) GmFT1a 在根部過量表達(dá)時(shí)，植株有延遲開花的趨勢(shì)（圖 4.14 A, B）。隨機(jī)選取部分植株取其根部，提取根部 RNA 后反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行 GmFT1a 表達(dá)量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)一部分植株根部 GmFT1a 的表達(dá)量高于對(duì)照，而有一部分植株根部的表達(dá)量并沒有明顯的升高（圖4.13）。

86圖 5.1 樣品之間的 pearson 相關(guān)系數(shù)Figure 5.1 Pearson correlation between samples5.2.3 各轉(zhuǎn)化株系中的差異基因數(shù)目比較為了分析兩個(gè)轉(zhuǎn)化株系表達(dá)譜的變化，對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)化事件的差異基因的表達(dá)水平（log10(FPKM+1)值），做層次聚類(hierarchical clustering)分析。通過圖 5.2 A 發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株基因表達(dá)差異較大，而兩個(gè)轉(zhuǎn)化事件相比于野生型，差異基因上調(diào)和下調(diào)的趨勢(shì)相同（圖 5.2A）。轉(zhuǎn)化事件#10 （T10）相比于野生型有 3120 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因 1426 個(gè)，下調(diào)基因 1694 個(gè)（圖 5.2 B）；而轉(zhuǎn)化事件#9（T46）相比于野生型僅有 670 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因 224 個(gè)，下調(diào)基因 446 個(gè)（圖 5.2 C）。韋恩圖顯示，轉(zhuǎn)化事件# 9 的 670 個(gè)差異基因中 90.4%（606 個(gè)）的差異基因都包含于 T10 的差異基因中（圖 5.2 D）。

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本文編號(hào)：2763790