【摘要】：泥鰍是東亞國家,最重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類之一。隨著泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,由病原導致的感染性疾病越來越嚴重,尤其是細菌性疾病,這給我國的泥鰍養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失。然而,現(xiàn)在對泥鰍抗細菌感染的免疫機制的研究卻并不是很多。補體系統(tǒng)是機體很重要的免疫防御系統(tǒng),而補體C3是補體系統(tǒng)3條激活途徑的一個中心分子,這3條激活途徑最終都會回歸到C3轉(zhuǎn)化酶的形成,和共享最后的終末溶解途徑。本論文利用分子克隆的方法對泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)補體C3基因進行了克隆與鑒定,構(gòu)建了補體C3基因的系統(tǒng)進化樹,分析了補體C3基因的m RNA在不同組織中的表達水平。并且在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了嗜水氣單胞菌浸泡感染泥鰍的模型。用蘇木精/伊紅染色(HE染色)呈現(xiàn)了皮膚和鰓在感染以后的形態(tài)變化規(guī)律,用q PCR分析了泥鰍補體C3基因和其它9種補體相關(guān)基因在感染以后m RNA的表達規(guī)律,并以此構(gòu)建了基因表達的熱圖。1.利用實驗室已經(jīng)獲得的泥鰍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫比對分析,經(jīng)過PCR驗證發(fā)現(xiàn)了在泥鰍中存在3種C3亞型,分別命名為C3-1、C3-2和C3-3�？寺〕隽四圉qC3-1的全長c DNA序列。C3-1 c DNA序列由4509 bp核苷酸組成,預(yù)測編碼1454個氨基酸。C3-1的氨基酸序列中存在對C3功能非常重要的保守結(jié)構(gòu)域。并且還在C3-1的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)典型的硫酯鍵序列(GCGEQ)存在一個氨基酸的突變。補體C3的系統(tǒng)進化樹顯示泥鰍補體C3-1與鯉科魚類的補體C3親緣關(guān)系較近。檢測了3種C3亞型mRNA在腎臟、眼睛、脾臟、性腺、心臟、鰭條、腸道、肌肉、大腦、鰓、皮膚、血液和肝臟中的表達情況。發(fā)現(xiàn)C3-1和C3-3的表達模式類似,主要在肝臟中表達,然后是脾臟和性腺。然而,C3-2 m RNA的表達卻與C3-1和C3-3有所不同。C3-2主要在腎臟中表達,然后是血液和性腺。2.用1×10~7CFU/ml的嗜水氣單胞菌浸泡感染泥鰍,研究發(fā)現(xiàn)泥鰍在受到嗜水氣單胞菌浸泡感染以后,它的皮膚和鰓會有一個很明顯的形態(tài)變化。與對照組相比,泥鰍的次級鰓絲會變得又短又寬,而皮膚的表皮層也會有一個明顯的變寬。3.用1×10~7CFU/ml的嗜水氣單胞菌浸泡感染泥鰍,研究發(fā)現(xiàn)泥鰍在受到嗜水氣單胞菌浸泡感染以后,C3-1和C3-3基因的m RNA的表達規(guī)律在鰓和皮膚中類似,分別在鰓的36 h和皮膚的24 h有一個顯著的上調(diào)表達。而C3-2在鰓和皮膚中達到上調(diào)表達峰值的時間點都是感染以后48 h。在感染以后,3種C3亞型m RNA的表達在肝臟和脾臟中的表達都呈現(xiàn)出了一個很明顯的上調(diào)趨勢。同樣的,我們也檢測了一些補體調(diào)控相關(guān)的基因表達,BF、C1qb、C2b、C3aR、C3b、C4、C5、C8b和MASP-1。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)補體相關(guān)基因的表達在鰓、皮膚和肝臟中也出現(xiàn)了一個上調(diào)的趨勢,只是上調(diào)的倍數(shù)有所差異。本研究是第一次在泥鰍中報道存在3種C3亞型,并且首次克隆出了泥鰍補體C3-1的全長c DNA序列。3種C3亞型在許多組織中都有所表達,只是表達水平有所差異。泥鰍在受到嗜水氣單胞菌感染以后,皮膚和鰓會有一個很明顯的形態(tài)變化。而感染實驗也可以造成3種C3亞型和其它補體基因在鰓,皮膚和肝臟中的表達上調(diào)。綜上所述,我們的研究暗示著補體C3可能在黏膜組織抗細菌感染的過程中,發(fā)揮了一個重要的作用。本研究的結(jié)果同樣也可以為后續(xù)補體C3的功能研究提供一個很堅實的基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1. 后口動物的系統(tǒng)進化樹 (Nonaka, 2001)Fig.1-1. Phylogenetic tree of deuterostomes (Nonaka, 2001)1.1.1 經(jīng)典途徑經(jīng)典途徑可以被抗原抗體復(fù)合物激活�？贵w（IgG 或者 IgM）的 Fc 片段和補體 C1 的 C1q 部分相結(jié)合，從而激活了 C1s 和 C1r,C1s 能夠?qū)?C4 酶解成 C4b和 C4a, C4b 可以通過硫酯鍵與抗原微生物結(jié)合。然后 C2 從而與 C4b 結(jié)合，與C4b 結(jié)合的 C2 從而被 C1 酶解成 C2a 和 C2b。C2a 繼續(xù)與 C4b 結(jié)合形成經(jīng)典途徑的 C3 轉(zhuǎn)化酶（C4b2a）。C4b2a 可以將天然的 C3 酶解成 C3a 和 C3b，而 C3b與 C4b2a 結(jié)合又可以生成經(jīng)典途徑的 C5 轉(zhuǎn)化酶（C4b2a3b）(PangburnandRawal2002)。而C4b2a3b可以將C5裂解成C5a和C5b,而C5b是攻膜復(fù)合體（MembraneAttack Complex, MAC）的起始成分。C5b 與補體成份 C6-C9 在靶細胞膜上相互作用形成 MAC，導致靶細胞溶解 (Zhu et al., 2005)。

但當機體識別出入侵的病原體或外源異物的表面蛋白質(zhì)時，C3b 就會與 Bf 以非共價鍵的形式結(jié)合，此時 Df 激活 Bf，并使其酶解成 Ba 和 Bb，其中的 Bb 和 C3b 相互結(jié)合形成 C3 轉(zhuǎn)化酶（C3bBb），此 C3 轉(zhuǎn)化酶能將機體內(nèi)原本非活化的 C3 大量酶解成 C3a 和 C3b，其中 C3b 和 C3 轉(zhuǎn)化酶結(jié)合而形成關(guān)鍵因子 C5 轉(zhuǎn)化酶（C3bBb3b）,進而形成 MAC 發(fā)揮作用。1.1.3 凝集素途徑凝集素途徑類似于經(jīng)典途徑，它需要凝集素，比如甘露糖結(jié)合凝集素（MBL）或者纖維膠原素，與微生物表面的含糖聚合物相互作用才能被激活 (Fujita et al.,2010)。當凝集素和微生物表面的含糖聚合物結(jié)合以后，MBL 相關(guān)的絲氨酸蛋白酶（MASPs）被激活。這些酶蛋白在結(jié)構(gòu)上已經(jīng)被證實類似于 C1r 和 C1s (Simand Laich, 2004)。因此，此復(fù)合物與經(jīng)典途徑中的 C1s 和 C1r 功能相似，將 C2和 C4 裂解后再相互結(jié)合形成 C3 轉(zhuǎn)化酶，進而導致終末溶解途徑的形成。

圖 1-3. 補體系統(tǒng)的激活以后的功能 (Boshra et al., 2006)Fig.1-3. The function of complement system (Boshra et al., 2006)1.3 補體組成成分補體激活是一個級聯(lián)放大的過程，這個過程復(fù)雜而又精密，并且有許多補體分子參與其中。有許多分子都有相似的特點，并且這些分子被認為是同一個基因的復(fù)制產(chǎn)物。舉個例子，我們通常認為 C3，C4 還有 C5 是起源于同一個祖先基因，這個祖先基因最有可能是血漿蛋白酶抑制劑α-2 巨球蛋白，這個蛋白目前仍然存在于無脊椎動物中。α-2 巨球蛋白是從何時演變成 C3，C4 和 C5 這三種補體蛋白的，至今仍不清楚 (Zarkadisetal.,2001a)。現(xiàn)在已經(jīng)從許多種無脊椎動物中分離出了與補體 C3 高度類似的分子 (Smith et al., 1999)，這說明 C3 的出現(xiàn)是早于 C4 和 C5 的。另外 C1s/C1r/MASP，Bf/C2，C6/C7/C8/C9 都被認為具有共同的起源。

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