【摘要】：背景:銀屑病是一種較為常見的慢性炎癥性皮膚病,以皮膚鱗屑性紅斑為主要臨床表現(xiàn),是遺傳因素、環(huán)境因素和自身免疫共同相互作用結(jié)果,其易復發(fā)、難治愈,嚴重影響患者的身心健康。然而,銀屑病確切的病因和發(fā)病機制至今仍未完全闡明是皮膚科領域亟待解決的難題之一。目前認為銀屑病的發(fā)病機制是T細胞和樹突細胞活化,炎癥髓樣樹突狀細胞釋放IL-23和IL-12以活化產(chǎn)生IL-17的T細胞,Th1細胞和Th22細胞以產(chǎn)生大量的銀屑病細胞因子IL-17,IFN-γ,TNF和IL-22,這些細胞因子又作用于角質(zhì)形成細胞以加重銀屑病炎癥,最終導致角質(zhì)形成細胞的增殖、分化、凋亡異常,形成了臨床可見的銀屑病特征性皮損。全基因組關聯(lián)分析研究成為發(fā)現(xiàn)復雜疾病易感基因最常用的方法之一。GWAS發(fā)現(xiàn)大量的銀屑病易感基因,其中具有免疫功能的IL28RA基因為中國漢族人銀屑病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感基因,也是歐洲人群銀屑病的易感基因。由該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于II類細胞因子受體家族,位于染色體1p36.11,由9個外顯子編碼蛋白質(zhì)。目前研究較多是IL28RA與IL10Rβ形成受體復合物,再與三個密切相關的細胞因子IL-28A,IL-28B及IL-29相互作用發(fā)揮抗病毒、抗增殖的作用,IL28RA基因在銀屑病中發(fā)病機制研究國內(nèi)外還尚未見報道。銀屑病是人類特有的疾病,所有的動物銀屑病模型都是模擬人類銀屑病的近似情況。實驗局部應用TLR7/8激動劑咪喹莫特引起小鼠銀屑病樣皮膚炎癥來模擬人類銀屑病模型。該模型模擬銀屑病發(fā)病機制中關鍵部分,包括漿細胞樣樹突狀細胞的激活和對Th17細胞的依賴。目的:本研究構(gòu)建體外IL28RA過表達和低表達細胞模型檢測其對人類永生性皮膚角質(zhì)細胞系(HaCaT)的增殖,分化影響及參與其中的信號通路,試圖闡明IL28RA基因在HaCaT細胞中的作用機制,推測它在銀屑病皮損形成及其在銀屑病發(fā)病機制中的作用。本實驗構(gòu)建低劑量咪喹莫特誘導銀屑病樣皮損增厚的小鼠體外模型,檢測細胞因子mIL-28A對小鼠皮損作用效果。方法:本實驗利用免疫組化和Western Blot方法檢測10例銀屑病患者非皮損和皮損中IL28RA蛋白表達差異;脂質(zhì)體LIP3000介導的cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HaCaT細胞構(gòu)建穩(wěn)定IL28RA過表達,低表達及其對照的空載細胞系。MTS方法檢測細胞增殖、傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力;Western Blot方法檢測細胞周期蛋白(CyclinB1和CyclinE)和分化蛋白(Involucrin和Loricrin)表達;流式細胞儀檢測細胞周期分布;由于IL28RA和IL10R?組成受體復合物,因此加入配體IL-29刺激后再檢測其增殖、細胞周期蛋白、細胞周期、分化蛋白的表達及檢測參與增殖和分化的信號通路;Real-time PCR檢測分化標志物mRNA的表達水平;低劑量咪喹莫特(1.56 mg/只)誘導小鼠皮損呈現(xiàn)銀屑病樣增厚,用等劑量咪喹莫特與mIL-28A(100 ng/μl)均勻混合涂抹小鼠背部,連續(xù)一周涂抹后處死小鼠。取背部皮做HE染色觀察其病理形態(tài)學和Western Blot檢測各組小鼠背部皮膚中IL28RA的表達。結(jié)果:與患者正常皮膚表達相比,IL28RA蛋白在銀屑病患者皮損中低表達;和轉(zhuǎn)染對照相比,IL28RA基因過表達能下調(diào)周期蛋白CyclinB1和上調(diào)CyclinE表達,加入IL-29(100 ng/ml)刺激結(jié)果顯示IL28RA過表達分別下調(diào)CyclinB1和上調(diào)CyclinE;MTS檢測細胞增殖和傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力顯示IL28RA基因過表達抑制HaCaT細胞增殖,抑制細胞遷移;和對照細胞相比,低表達IL28RA促進細胞HaCaT增殖,加快細胞遷移;加入IL-29(100 ng/ml)刺激,IL28RA基因過表達受到抑制較對照組細胞增殖抑制顯著;IL-29(100ng/ml)刺激后對細胞傷口愈合實驗無明顯影響;流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)IL28RA基因過表達使細胞周期阻滯在S期,加入IL-29(100 ng/ml)刺激后,細胞抑制在G2/M期;IL-29(100 ng/ml)加入通過激活JAK-STAT信號通路抑制HaCaT細胞增殖,上調(diào)磷酸化STAT1;特定的抑制劑JAKI能抑制JAK-STAT信號通路;和對照細胞相比,IL28RA基因過表達上調(diào)角質(zhì)細胞分化標志物(Involucrin和Loricrin)表達,而IL28RA基因低表達下調(diào)角質(zhì)細胞分化標志物(Involucrin和Loricrin)表達。IL-29(100 ng/ml)通過激活JAK-STAT信號通路抑制鈣離子誘導角質(zhì)細胞分化標志物mRNA的表達。HE染色結(jié)果顯示:對照組小鼠相比,低劑量咪喹莫特(1.56 mg/只)誘導小鼠皮損呈現(xiàn)銀屑病樣增厚;低劑量咪喹莫特(1.56 mg/只)與mIL-28A(100 ng/μl)均勻混合使皮損增厚顯著,提示mIL-28A處理加重了小鼠皮損炎癥。Western Blot檢測與凡士林對照組小鼠皮膚相比,IL28RA蛋白在低劑量咪喹莫特處理組與mIL-28A混合處理組小鼠皮損中呈現(xiàn)低表達;結(jié)果提示這與IL28RA在人類銀屑病中表達相類似。結(jié)論:IL28RA蛋白在銀屑病患者皮損中低表達,提示其異常表達可能與銀屑病角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化過程相關;體外實驗證明IL-29細胞因子通過IL28RA受體復合物激活JAK-STAT信號通路抑制HaCaT角質(zhì)細胞增殖和分化。mIL-28A與低劑量咪喹莫特混勻涂抹顯示mIL-28A會加重小鼠皮損的炎癥,促進小鼠銀屑病樣皮損形成。因此,我們推測IL28RA易感基因可能參與中國漢族人群銀屑病發(fā)病機制,IL28RA可以作為一個潛在的分子靶點,為銀屑病的治療提供新的方向。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R758.63
【圖文】：

圖 1. pCMV6-Entry 質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖Fig1. The structure of pCMV6-Entry plasmid1）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化-80℃取 40 μl DH5α 感受態(tài)細胞懸液，室溫解凍后立即置于冰上。 1.5 ml 的 EP 管中。編號 1，2 號。往 1 號管加入 1 μl 重組體 IL28RA-p務必離心，并加入 50 μl 的 TE 溶解)，1 μl 空質(zhì)粒 pCMV6 分別與 胞混勻，冰上放置 30 min。42℃水浴鍋中熱擊 90 秒，熱擊后迅速置n。接著向管中加入 1 ml LB 液體培養(yǎng)基,混勻后 37℃震蕩培養(yǎng) 1 小正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼抗生素基因。將上述菌液搖勻后取轉(zhuǎn)移至 1.5 ml 離心管中離心，上清扔掉，余 100 μl 混勻）涂布于的篩選平板上，正面放 30 min,待菌液被培養(yǎng)基吸收完成后倒置培養(yǎng)-24 小時。

圖 2. IL28RA 蛋白在患者正常和皮損組織中的表達。(A) Western Blot 分析 IL28RA 蛋白在正常皮膚和銀屑病皮損表達(n=10)（左）和各組相對 IL28RA 蛋白水平的定量（右），** P <0.01；(B) 免疫組化染色檢測 IL28RA 蛋白(a, c)和陰性對照(b, d)表達，標尺=20 μm。實驗至少重復三次，t-test 用于檢驗，與正常對照組相比，**P <0.01。Fig2. Expression of IL28RA protein was examined in normal skin and lesions of patients withplague psoriasis. (A) Western blot analysis of the expression of IL28RA in in normal skin andlesions of patients with plague psoriasis (n=10) (left) and quantification of relative IL28RA proteinlevel in each group (right), ** P <0.01, compared with control group. (B) The expression of IL28RAin in normal skin and lesions of patients with plague psoriasis by IHC staining (a, c) and negativecontrol (b, d). Scale bars = 20 μm. A t-test was performed. Data shown were the mean ± SD andrepresentative of at least 3 independent experiments. **P <0.01 compared with control group.

安徽醫(yī)科大學博士學位論文4.2 質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染 HaCaT 細胞驗證4.2.1 pCMV6 對照質(zhì)粒和過表達 IL28RA 質(zhì)粒擴增將 pCMV6 對照質(zhì)粒和過表達 IL28RA 質(zhì)粒分別通過轉(zhuǎn)化實驗，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，搖菌，通過挑取單克隆擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒，測序，經(jīng)過 Blast 比對，與原來質(zhì)粒序列相同。

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