【摘要】：錨定重復蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三個保守的成員組成:心肌錨定重復蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌錨定重復蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和錨定重復蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本試驗根據(jù)實驗室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉錄組測序數(shù)據(jù),對兩個轉錄本差異表達基因進行篩選,挖掘到差異表達基因ANKRD2為本研究的目的基因。ANKRD2基因特異性表達于骨骼肌,在骨骼肌生長發(fā)育過程中起重要作用,參與肌細胞的分化與肌纖維的形成和成熟。目前關于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子結構和組織表達尚未見報道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全長cDNA序列并對其編碼的蛋白進行了一系列的生物信息學分析,在mRNA水平和蛋白水平上對小尾寒羊和杜泊羊的組織表達進行了分析。主要研究結果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全長cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全長1179 bp,包含990 bp的開放閱讀框、21 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)和168 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)。其中,開放閱讀框編碼329個氨基酸的多肽鏈。我們克隆該基因并將其提交在Genbank上,登陸號是KR090892。在NCBI上下載該基因的預測序列,與我們克隆的序列進行比對,發(fā)現(xiàn)相似率約99.40%,CDS區(qū)存在2個堿基突變位點。(2)生物信息學分析顯示,ANKRD2基因編碼的蛋白分子量為36.7 kDa,脂溶指數(shù)為87.48(60),蛋白的流動性較大。不穩(wěn)定指數(shù)為49.57(40),蛋白的穩(wěn)定性一般。疏水性指數(shù)為-0.6,說明它為水溶性蛋白,且親水性較好。等電點為5.72,為偏酸性蛋白,氨基酸組分最多的是谷氨酸。預測蛋白質的二級結構是α螺旋和無規(guī)則卷曲。生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn)其C值、S值和Y值均小于0.5,推斷其不含有蛋白信號肽,屬于非跨膜蛋白,故不能被分泌到細胞外發(fā)揮作用。在氨基酸序列中,發(fā)現(xiàn)14個磷酸化位點,12個泛素化位點,10個糖基化位點,4個錨定重復結構域。利用Swiss-model軟件預測發(fā)現(xiàn)模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)與我們所研究的蛋白擁有最相似的三級結構。(3)將獲得的小尾寒羊該基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)小尾寒羊ANKRD2氨基酸與所選物種的相似性均在86%以上,說明該蛋白在哺乳動物中高度保守,系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)綿羊的遺傳距離與山羊、牛、馬相距較近,與人類、豬、鼠、虎鯨的遺傳距離相距較遠。(4)通過熒光定量PCR和Western-blot技術分析該基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的組織間的表達情況,發(fā)現(xiàn)該基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈現(xiàn)出組織表達差異性。研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表達,在骨骼肌中的表達量最高,顯著高于其他組織(p0.05)。此外,在骨骼肌組織中,杜泊羊ANKRD2蛋白表達量顯著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他組織中,蛋白表達量無顯著差異。綜上所述,本研究從mRNA水平和蛋白水平對小尾寒羊ANKRD2基因展開了較為系統(tǒng)的研究,并且驗證了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同組織中的表達情況,為地方品種小尾寒羊經(jīng)濟性狀的改良和分子育種提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【圖文】：

3 結果與分析3.1 克隆測序與核苷酸序列分析3.1.1 總 RNA 的提取試驗采用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳對我們前期提取的總 RNA 進行檢測，檢測結果如圖 3-1 所示，電泳圖顯示我們提取的總 RNA 的 28 S 和 18 S 兩條帶清晰明亮，沒有拖尾的現(xiàn)象，說明我們提取的總 RNA 的完整比較好，沒有受到 DNA 或者蛋白質的污染，提取的 RNA 可以用于我們后續(xù)實驗研究。使用核酸蛋白分析儀檢測我們提取的總 RNA 的濃度和 OD 值，結果顯示，提取的總 RNA 的濃度值為 262.3，OD 值為 1.96（1.8-2.0 之間），說明我們提取的總 RNA 的純度比較較高，且沒有受到蛋白質和 DNA的污染。

山東農業(yè)大學碩士學位論文目的條帶，我們獲得一段 990 bp 的基因片段，測序序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫提供羊 ANKRD2 基因預測序列的相似度在 99%以上，只有 2 個堿基存在不同。試驗所的 DNAMarker 為 DL2000，條帶從上到下一次為：2000 bp; 1000 bp; 750 bp; 5000 bp; 100 bp。

圖 3-3 骨骼肌錨定重復蛋白基因 3' RACE 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3-3 Agarose electrophoresis of extraction of Ankrd2 3' RACE3.1.4 ANKRD2 基因 5' RACE 擴增及其測序利用華大基因設計的特異性引物 5' I 與 5' O，以及 5' RACE 試劑盒內提供的 5RACE Outer Primer 與 5' RACE Inner Primer 進行巢式 PCR 反應，瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)我們擴增的產(chǎn)物大小與前期預計所應該獲得的片段長度大體一致，由電泳圖可知，沒有非特異性引物和引物二聚體的出現(xiàn)通過上海生工科技有限公司測序，圖 3-4 中最明亮的條帶是我們克隆的目的條帶，我們獲得一段 203 bp 的基因片段。試驗所選用的DNA Marker 為 DL 2000，條帶從上到下一次為：2000 bp; 1000 bp; 750 bp; 500 bp; 250 bp100 bp。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 趙曉;莫德林;張悅;龔雯;李安寧;陳瑤生;;豬的骨骼肌生長發(fā)育研究進展[J];生命科學;2011年01期

2 蔣瑤;陳其兵;;植物CBF1轉錄因子的生物信息學分析[J];林業(yè)科學;2010年06期

本文編號：2759994