【摘要】：錨定重復(fù)蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三個(gè)保守的成員組成:心肌錨定重復(fù)蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌錨定重復(fù)蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和錨定重復(fù)蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,挖掘到差異表達(dá)基因ANKRD2為本研究的目的基因。ANKRD2基因特異性表達(dá)于骨骼肌,在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用,參與肌細(xì)胞的分化與肌纖維的形成和成熟。目前關(guān)于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析,在mRNA水平和蛋白水平上對(duì)小尾寒羊和杜泊羊的組織表達(dá)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全長(zhǎng)1179 bp,包含990 bp的開(kāi)放閱讀框、21 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)和168 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)。其中,開(kāi)放閱讀框編碼329個(gè)氨基酸的多肽鏈。我們克隆該基因并將其提交在Genbank上,登陸號(hào)是KR090892。在NCBI上下載該基因的預(yù)測(cè)序列,與我們克隆的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)相似率約99.40%,CDS區(qū)存在2個(gè)堿基突變位點(diǎn)。(2)生物信息學(xué)分析顯示,ANKRD2基因編碼的蛋白分子量為36.7 kDa,脂溶指數(shù)為87.48(60),蛋白的流動(dòng)性較大。不穩(wěn)定指數(shù)為49.57(40),蛋白的穩(wěn)定性一般。疏水性指數(shù)為-0.6,說(shuō)明它為水溶性蛋白,且親水性較好。等電點(diǎn)為5.72,為偏酸性蛋白,氨基酸組分最多的是谷氨酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)其C值、S值和Y值均小于0.5,推斷其不含有蛋白信號(hào)肽,屬于非跨膜蛋白,故不能被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。在氨基酸序列中,發(fā)現(xiàn)14個(gè)磷酸化位點(diǎn),12個(gè)泛素化位點(diǎn),10個(gè)糖基化位點(diǎn),4個(gè)錨定重復(fù)結(jié)構(gòu)域。利用Swiss-model軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)與我們所研究的蛋白擁有最相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。(3)將獲得的小尾寒羊該基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)小尾寒羊ANKRD2氨基酸與所選物種的相似性均在86%以上,說(shuō)明該蛋白在哺乳動(dòng)物中高度保守,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)綿羊的遺傳距離與山羊、牛、馬相距較近,與人類(lèi)、豬、鼠、虎鯨的遺傳距離相距較遠(yuǎn)。(4)通過(guò)熒光定量PCR和Western-blot技術(shù)分析該基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的組織間的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)該基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈現(xiàn)出組織表達(dá)差異性。研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表達(dá),在骨骼肌中的表達(dá)量最高,顯著高于其他組織(p0.05)。此外,在骨骼肌組織中,杜泊羊ANKRD2蛋白表達(dá)量顯著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他組織中,蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異。綜上所述,本研究從mRNA水平和蛋白水平對(duì)小尾寒羊ANKRD2基因展開(kāi)了較為系統(tǒng)的研究,并且驗(yàn)證了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同組織中的表達(dá)情況,為地方品種小尾寒羊經(jīng)濟(jì)性狀的改良和分子育種提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S826
【圖文】：

3 結(jié)果與分析3.1 克隆測(cè)序與核苷酸序列分析3.1.1 總 RNA 的提取試驗(yàn)采用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳對(duì)我們前期提取的總 RNA 進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖 3-1 所示，電泳圖顯示我們提取的總 RNA 的 28 S 和 18 S 兩條帶清晰明亮，沒(méi)有拖尾的現(xiàn)象，說(shuō)明我們提取的總 RNA 的完整比較好，沒(méi)有受到 DNA 或者蛋白質(zhì)的污染，提取的 RNA 可以用于我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)我們提取的總 RNA 的濃度和 OD 值，結(jié)果顯示，提取的總 RNA 的濃度值為 262.3，OD 值為 1.96（1.8-2.0 之間），說(shuō)明我們提取的總 RNA 的純度比較較高，且沒(méi)有受到蛋白質(zhì)和 DNA的污染。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文目的條帶，我們獲得一段 990 bp 的基因片段，測(cè)序序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)提供羊 ANKRD2 基因預(yù)測(cè)序列的相似度在 99%以上，只有 2 個(gè)堿基存在不同。試驗(yàn)所的 DNAMarker 為 DL2000，條帶從上到下一次為：2000 bp; 1000 bp; 750 bp; 5000 bp; 100 bp。

圖 3-3 骨骼肌錨定重復(fù)蛋白基因 3' RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3-3 Agarose electrophoresis of extraction of Ankrd2 3' RACE3.1.4 ANKRD2 基因 5' RACE 擴(kuò)增及其測(cè)序利用華大基因設(shè)計(jì)的特異性引物 5' I 與 5' O，以及 5' RACE 試劑盒內(nèi)提供的 5RACE Outer Primer 與 5' RACE Inner Primer 進(jìn)行巢式 PCR 反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)我們擴(kuò)增的產(chǎn)物大小與前期預(yù)計(jì)所應(yīng)該獲得的片段長(zhǎng)度大體一致，由電泳圖可知，沒(méi)有非特異性引物和引物二聚體的出現(xiàn)通過(guò)上海生工科技有限公司測(cè)序，圖 3-4 中最明亮的條帶是我們克隆的目的條帶，我們獲得一段 203 bp 的基因片段。試驗(yàn)所選用的DNA Marker 為 DL 2000，條帶從上到下一次為：2000 bp; 1000 bp; 750 bp; 500 bp; 250 bp100 bp。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 趙曉;莫德林;張悅;龔雯;李安寧;陳瑤生;;豬的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2011年01期

2 蔣瑤;陳其兵;;植物CBF1轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析[J];林業(yè)科學(xué);2010年06期

本文編號(hào)：2759994