【摘要】：目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要依賴(lài)于化學(xué)農(nóng)藥,但是化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來(lái)了一系列的問(wèn)題,因此使用一種具有特異、高效的生物殺蟲(chóng)劑蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)占主要地位,它廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)及醫(yī)學(xué)害蟲(chóng)的防治,其生產(chǎn)量和使用量占微生物農(nóng)藥的95%以上。蘇云金芽胞桿菌可產(chǎn)生晶體蛋白和可溶性分泌蛋白,并且這些蛋白對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)具有高效特異的殺蟲(chóng)活性,因此在全球范圍內(nèi)得到普遍應(yīng)用。正是這種殺蟲(chóng)蛋白的效用,也促使我們識(shí)別和鑒定出具有不同特異性的新的殺蟲(chóng)蛋白,從而在土壤環(huán)境中分離出更多的新型Bt資源,并且具有殺蟲(chóng)特性的Cry蛋白已經(jīng)廣泛被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治,但目前仍然有其他的Bt蛋白還未有明確其靶標(biāo)害蟲(chóng)。近年來(lái)由于在我國(guó)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的逐年加重,農(nóng)作物的產(chǎn)量逐年下降。因此,現(xiàn)在急需尋找新型的殺蟲(chóng)活性基因這對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治具有非常重要意義。本文針對(duì)我國(guó)棉田鱗翅目害蟲(chóng)進(jìn)行了菌株的篩選與殺蟲(chóng)基因克隆的研究。本研究的主要內(nèi)容如下:(1)從中國(guó)海南地區(qū)采集到2300份土壤,分離出Bt菌株755株,其伴胞晶體類(lèi)型有長(zhǎng)雙錐體形、短雙錐體形、球形等,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知的基因序列設(shè)計(jì)通用引物,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法,對(duì)2300株Bt菌株基因池DNA混合樣品進(jìn)行PCR鑒定。序列分析結(jié)果表明,這些Bt菌株基因池中含有2種cry2類(lèi)基因,分別為cry2Ab基因和cry2Ag基因,擴(kuò)增得到cry2Ab和cry2Ag的全長(zhǎng)基因序列,分別為1902bp和1891 bp,已提交cry2Ab基因序列(Gen Bank登錄號(hào)為KX357382)和cry2Ag基因序列(Gen Bank登錄號(hào)為KX236449)。分別構(gòu)建p EB-Cry2Ab和pEB-Cry2Ag表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá),通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示,兩種Cry2類(lèi)蛋白均可以表達(dá)出分子量為70 kDa的殺蟲(chóng)晶體蛋白。將得到的兩種殺蟲(chóng)晶體蛋白分別對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)害蟲(chóng)小菜蛾(Plutella xylostella)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)進(jìn)行生物活性的初篩測(cè)定,選取初篩活性較高的蛋白再進(jìn)行復(fù)篩,復(fù)篩結(jié)果顯示,成功表達(dá)的兩種蛋白對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲(chóng)具有較高的殺蟲(chóng)活性。(2)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的海南地區(qū)菌株Bt BJH500、Bt BJH498進(jìn)行基因鑒定,通過(guò)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)其中含有cry4基因,再利用全長(zhǎng)引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果獲得cry4-like全長(zhǎng)基因序列。該序列已提交Gen Bank注冊(cè),登錄號(hào)為KX244950。將得到的全長(zhǎng)基因與p EB載體相連,構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌BL21中成功表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE結(jié)果顯示,可以在大腸桿菌中表達(dá)出分子量為43 kDa的晶體蛋白。將表達(dá)得到的晶體蛋白對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行生物活性初步測(cè)定,其校正死亡率都較低,結(jié)果分析該蛋白對(duì)小菜蛾、棉鈴蟲(chóng)均無(wú)顯著殺蟲(chóng)活性。本研究針對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室保存的海南地區(qū)菌株,進(jìn)行菌株篩選、基因型的鑒定與殺蟲(chóng)活性的測(cè)定,獲得有效菌株Bt BJH500和Bt BJH498。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法成功克隆殺蟲(chóng)基因3個(gè)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種Cry2類(lèi)蛋白對(duì)三種鱗翅目(Lepidoptera)害蟲(chóng)小菜蛾(Plutella xylostella)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有一定的殺蟲(chóng)活性。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S482.39;Q78
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文最后，同源性高于 95%的蛋白在第四等級(jí)里進(jìn)行類(lèi)別區(qū)分[18]。不管怎樣，這種法可為每個(gè)獨(dú)立編碼蛋白的基因序列進(jìn)行分類(lèi)，因此，盡管有些蛋白可能在第四但實(shí)際上它們的氨基酸序列也可能是相同的[18]。這種命名系統(tǒng)通常用于 Bt 蛋素（Cry 和 Cyt）和分泌蛋白（Vip 和 Sip）的命名與分類(lèi)。到目前為止，共Cry1-Cry74，Cyt1-Cyt3，Vip1-Vip4，Sip）包括 349 種模式基因。

盡管結(jié)果發(fā)現(xiàn)這九種毒素蛋白的氨基酸序列和殺蟲(chóng)特異性差別較大，但它們活性區(qū)域卻具有一致的結(jié)構(gòu)：即大部分ICPs的結(jié)構(gòu)域主要包括Domain I、Domain II和Domain III（圖1-3）。Domain I位于活性Cry蛋白的N-末端于1991年由Li等首次報(bào)道[30]。它包括一個(gè)α-螺旋束，在這個(gè)α-螺旋束中，一個(gè)疏水的 -螺旋中心由有6個(gè)反向平行的 -螺旋圍繞著形成（圖1-3）。有研究認(rèn)為Domain I會(huì)與毒素寡發(fā)生聚化、插入細(xì)胞膜以及空洞形成有關(guān)[31]，在Domain Ⅱ中是由三個(gè)反向平行的β-折疊構(gòu)成一個(gè)β棱柱（ -prism）結(jié)構(gòu)（圖1-3）[30]，其中兩個(gè)折疊片暴露在外側(cè)表面的而且是由希臘鑰匙的四條單鏈組成的。這種結(jié)構(gòu)被形象地稱(chēng)為“Greek Key”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由由四個(gè)反向平行的 -折疊片段構(gòu)成。還發(fā)現(xiàn)與幼蟲(chóng)中腸蛋白的特異結(jié)合有關(guān)是暴露在外面的Loop區(qū)域[31]。近年來(lái)有研究表明，某些氨基酸的位點(diǎn)或區(qū)域與殺蟲(chóng)特異性有很大的關(guān)系是因?yàn)镃ry蛋白的DomainⅡ結(jié)構(gòu)上的Cry毒素結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。Cry毒素結(jié)構(gòu)是DomainⅡ中變化最多的結(jié)構(gòu)域[32]，DomainⅡ的該區(qū)域與免疫球蛋白的相似性足可以表明毒素蛋白的DomainⅡ區(qū)域在與受體結(jié)合中起著非常重要的作用[30]

Bt BJH500 Bt BJH498圖 3-1 光學(xué)顯微鏡下蘇云金芽胞桿菌的晶體形態(tài)Fig. 3-1 The crystal shape of Bt strains under a microcope3.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組提取對(duì)從海南地區(qū)篩選出的 755 株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行基因組的提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖 3-2。從電泳結(jié)果圖中可以看出，提取的基因組質(zhì)量和濃度較高，將提取質(zhì)量高的基因組作為模板用于后續(xù) PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張金波;李海濤;劉榮梅;束長(zhǎng)龍;高繼國(guó);;Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表達(dá)及殺蟲(chóng)活性分析[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2015年04期

2 孟鑫睿;路楊;劉艷微;徐文靜;馮樹(shù)丹;張正坤;;蘇云金芽胞桿菌一新菌株的鑒定及其殺蟲(chóng)活性[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2015年03期

3 陳桂花;束長(zhǎng)龍;李穎;宋福平;郭媛媛;李國(guó)勛;張杰;;基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高通量測(cè)序(PCR-HTS)聯(lián)用的cry2A基因鑒定方法[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2014年05期

4 關(guān)雄;蔡峻;;我國(guó)蘇云金桿菌研究60年[J];微生物學(xué)通報(bào);2014年03期

5 劉艷杰;李海濤;劉榮梅;高繼國(guó);;Bt新型基因sip的克隆、表達(dá)和生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年12期

6 王繼磊;劉迪秋;丁元明;葛鋒;李文嫻;田榮歡;;Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2010年04期

7 宋敏;林祥明;劉麗軍;;Cry基因家族的專(zhuān)利分布研究[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年01期

8 賈春生;;利用SPSS軟件計(jì)算殺蟲(chóng)劑的LC_(50)[J];昆蟲(chóng)知識(shí);2006年03期

9 王和平,丁峰;生物農(nóng)藥Bt的科學(xué)使用[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2005年11期

10 蔡啟良,劉子鐸,喻子牛;蘇云金芽胞桿菌生物活性成分研究進(jìn)展[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2003年02期

本文編號(hào)：2757422