【摘要】：家蠶在中國有著悠久的養(yǎng)殖歷史,是畜牧業(yè)的重要組成部分。雖然現(xiàn)代養(yǎng)殖已經(jīng)大幅度降低了養(yǎng)殖成本,但各種病害仍給桑蠶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。黑胸?cái)⊙堪麠U菌是家蠶一種常見的病原微生物,能夠感染家蠶并導(dǎo)致細(xì)菌性敗血癥。在感染家蠶的過程中,黑胸?cái)⊙堪麠U菌分泌伴孢晶體毒素,損傷家蠶組織并促進(jìn)細(xì)菌的入侵感染。α毒素作為伴孢晶體毒素的主要成分,對(duì)家蠶具有致死性,具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究使用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)合生物信息學(xué)的分析,以家蠶的中腸、血液、脂肪體和BmE細(xì)胞為材料,分析α毒素感染前后家蠶的基因表達(dá)模式以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò),闡明家蠶對(duì)α毒素的免疫應(yīng)答反應(yīng)。1.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析為了研究家蠶添食α毒素后的免疫應(yīng)答反應(yīng),采用α毒素處理家蠶和BmE細(xì)胞,收集家蠶的中腸、血液、脂肪體和BmE細(xì)胞,各收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù),然后提取總RNA用于構(gòu)建鏈特異的總RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序�？傆�(jì)使用48個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序并獲得原始數(shù)據(jù)157Gb,平均每個(gè)樣本含有30M reads。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾與序列矯正,獲得132Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù),平均每個(gè)樣本含有23M reads。通過計(jì)算樣本的medTIN值,分析原始序列的完整性,結(jié)果表明樣本無明顯降解。然后將質(zhì)控后的reads比對(duì)到silkDB數(shù)據(jù)庫中的參考基因組,各樣本的比對(duì)率達(dá)到80%左右。綜上所述,所有樣本的數(shù)據(jù)均達(dá)到轉(zhuǎn)錄組質(zhì)控要求,可用于全基因組表達(dá)模式比較分析。根據(jù)與參考基因組的比對(duì)結(jié)果,計(jì)算基因的表達(dá)量。結(jié)果表明不同組織內(nèi)基因的表達(dá)分布情況類似,即大部分基因的表達(dá)量較高,集中在32TMM附近,并且在毒素處理后基因表達(dá)量的整體分布會(huì)發(fā)生改變,如脂肪體、中腸和血液的基因表達(dá)量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),表明α毒素的處理會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)量發(fā)生變化。PCA分析顯示,PC1-3的方差百分比分別為:45.06%、26.92%以及18.07%,不同組織相互分離,并且組織之間并沒有明顯的相關(guān)性,表明不同組織樣本的基因表達(dá)模式存在明顯差異。2.差異基因分析基于負(fù)二項(xiàng)分布模型,計(jì)算所有基因的差異表達(dá)概率,并將差異倍數(shù)大于2且FDR值小于0.05的基因定義為差異基因,共鑒定到952個(gè)差異基因。在中腸、脂肪體、血液和BmE細(xì)胞中差異基因的數(shù)量分別為:238、555、295和32,上調(diào)基因的數(shù)量分別為:113、344、159和16,下調(diào)基因的數(shù)量分別為:125、211、136和16。差異基因在各組織中的分布情況顯示,11個(gè)基因同時(shí)在中腸、血液和脂肪體上調(diào),31個(gè)基因在不同組織的表達(dá)量變化情況不一致。以上結(jié)果說明,α毒素的處理會(huì)導(dǎo)致許多基因的表達(dá)量發(fā)生改變,并且不同組織響應(yīng)毒素的基因存在明顯差異。對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集分析,共富集到89個(gè)不同的GO分類,包括36個(gè)生物過程,46個(gè)分子功能以及7個(gè)細(xì)胞成分。差異基因富集的生物學(xué)途徑主要為:海藻糖合成途徑、檸檬酸運(yùn)輸途徑以及肽聚糖的分解代謝過程;分子功能主要為:檸檬酸跨膜運(yùn)輸活性、UDP合成活性、金屬蛋白酶活性以及氧運(yùn)輸活性;細(xì)胞成分主要為:胞外區(qū)域、肌蛋白復(fù)合物以及線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物。不同組織中差異基因的富集分析結(jié)果差異較大,中腸上調(diào)的基因主要富集在酪氨酸激酶信號(hào)通路,中腸下調(diào)的基因主要富集在幾丁質(zhì)代謝途徑,而脂肪體上調(diào)的基因則具有肌醇三磷酸活性。綜上所述,α毒素會(huì)影響家蠶體內(nèi)許多信號(hào)通路,且不同組織對(duì)α毒素的響應(yīng)方式存在明顯差異。3.差異表達(dá)lncRNA分析為了分析lncRNAs對(duì)α毒素免疫應(yīng)答,將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)比對(duì)到BmncRNA數(shù)據(jù)庫,該數(shù)據(jù)包括了 6281個(gè)家蠶的lncRNAs。通過表達(dá)量計(jì)算,獲得3888個(gè)lncRNA的reads count大于10,表達(dá)量集中在16TMM,相對(duì)于編碼基因,其總體表達(dá)水平相對(duì)較低。將差異倍數(shù)大于2且FDR值小于0.05的lncRNA定義為差異lncRNA,共鑒定到353個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs,在中腸、血液、脂肪體和BmE細(xì)胞中的個(gè)數(shù)分別為:103、85、193和19,其中上調(diào)的個(gè)數(shù)為:58、42、87以及11,下調(diào)的個(gè)數(shù)為:45、43、106以及8。差異lncRNA的表達(dá)量集中在32TMM,并且處理后整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。通過計(jì)算Jensen-Shannonscore對(duì)比差異lncRNAs和編碼基因的組織特異性,結(jié)果顯示lncRNAs比編碼基因具有更高的組織特異性。4.共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析為了構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),采用差異表達(dá)的lncRNAs和編碼基因的表達(dá)量進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,共鑒定到兩個(gè)主要的共表達(dá)模塊。其中一個(gè)模塊含有118個(gè)節(jié)點(diǎn),包括113個(gè)基因和5個(gè)lncRNAs。另一個(gè)模塊含有87個(gè)節(jié)點(diǎn),包括83個(gè)基因和4個(gè)lncRNAs。集群分析結(jié)果顯示,兩個(gè)模塊共含有139個(gè)集群,分別為82以及57,規(guī)模最小為2,最大為40。其中9個(gè)lncRNA形成51個(gè)集群,并有5個(gè)lncRNA能形成1個(gè)以上集群,最多的為bmlnct_1109,能形成32個(gè)集群。通過集群分析提取模塊中規(guī)模最大的集群,結(jié)果顯示其中一個(gè)集群內(nèi)有一個(gè)編號(hào)為AK382731的lncRNA,而另一個(gè)集群內(nèi)只含有基因。暗示差異基因可能受到lncRNA的調(diào)控,或者與lncRNA共同行駛生物學(xué)功能。富集分析的結(jié)果顯示,其中一個(gè)模塊內(nèi)的基因所參與的生物學(xué)途徑為幾丁質(zhì)代謝途徑,另一個(gè)模塊并沒有富集到特定的生物學(xué)途徑,但是該模塊內(nèi)的基因所編碼的蛋白與器官的解毒過程相關(guān),包括了絲蛋白酶、細(xì)胞色素P450等。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示lncRNAs和編碼基因存在潛在的相關(guān)性,為lncRNA在家蠶免疫應(yīng)答中的功能研究提供參考。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S881.2
【圖文】：

１．邋１．３細(xì)菌感染宿主模式逡逑細(xì)菌是種類最繁多的生命體，并且能夠適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，包括家蠶的體內(nèi)。逡逑病原細(xì)菌成功感染宿全需要幾個(gè)步驟，包括附著宿主細(xì)胞，在組織中繁殖，然后以某逡逑種方式入侵細(xì)胞，之后是細(xì)胞內(nèi)增值，進(jìn)而可能傳染其他組織。細(xì)菌通過多種方式與逡逑宿主進(jìn)行相互作用，包括單體結(jié)構(gòu)的附著物、入侵因子以及高度復(fù)雜的大分子等，例逡逑如ＩＩＩ型分泌系統(tǒng)和有伸縮性的ＩＶ型菌毛［１＜３］，該過程能夠?qū)е滤拗骷?xì)胞功能的改變以逡逑及疾病的發(fā)生。逡逑為了成功侵入宿主，細(xì)菌演化了許多的方法，其中之一就是分泌毒素。一些細(xì)菌逡逑霉素，包括穿孔毒素，能夠在細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜形成孔洞＃＿導(dǎo)致細(xì)胞膜逡逑通透性的增加并對(duì)組織造成損傷［１１］。細(xì)菌毒素還能夠擾亂免疫系統(tǒng)促進(jìn)感染和疾病的逡逑進(jìn)程，并導(dǎo)致宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，甚至死亡。細(xì)菌毒素的作用機(jī)＿多種多樣，逡逑對(duì)其進(jìn)行研究有利于病害的防治以及毒素的應(yīng)用。毒素的潛在應(yīng)用包括開發(fā)新的生物逡逑殺蟲劑、構(gòu)建抗蟲植以及應(yīng)用至ｌｊ醫(yī)藥行業(yè)等》逡逑Ｂｂ邋｜邋＃邐？邋１逡逑Ｚ、

圖１．邋１黑胸?cái)⊙堪麠U菌和伴孢晶體。（Ａ）黑胸?cái)⊙挎邨U菌；（Ｂ）伴孢晶體毒素。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｂｏｍｂｙｓｅｐｉｉｅｕｓ邋ａｎｄ邋ＰＣ．邋（Ａ）邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｅｉｔｓ；邋（Ｂ）邋ｐａｒａｓｐｏｒａｌ邋ｃｒｙｓｔａｌ．逡逑１．邋１．３細(xì)菌感染宿主模式逡逑細(xì)菌是種類最繁多的生命體，并且能夠適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，包括家蠶的體內(nèi)。逡逑病原細(xì)菌成功感染宿全需要幾個(gè)步驟，包括附著宿主細(xì)胞，在組織中繁殖，然后以某逡逑種方式入侵細(xì)胞，之后是細(xì)胞內(nèi)增值，進(jìn)而可能傳染其他組織。細(xì)菌通過多種方式與逡逑宿主進(jìn)行相互作用，包括單體結(jié)構(gòu)的附著物、入侵因子以及高度復(fù)雜的大分子等，例逡逑如ＩＩＩ型分泌系統(tǒng)和有伸縮性的ＩＶ型菌毛［１＜３］，該過程能夠?qū)е滤拗骷?xì)胞功能的改變以逡逑及疾病的發(fā)生。逡逑為了成功侵入宿主，細(xì)菌演化了許多的方法，其中之一就是分泌毒素。一些細(xì)菌逡逑霉素，包括穿孔毒素，能夠在細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜形成孔洞＃＿導(dǎo)致細(xì)胞膜逡逑通透性的增加并對(duì)組織造成損傷［１１］。細(xì)菌毒素還能夠擾亂免疫系統(tǒng)促進(jìn)感染和疾病的逡逑進(jìn)程，并導(dǎo)致宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，甚至死亡。細(xì)菌毒素的作用機(jī)＿多種多樣，逡逑對(duì)其進(jìn)行研究有利于病害的防治以及毒素的應(yīng)用。毒素的潛在應(yīng)用包括開發(fā)新的生物逡逑殺蟲劑、構(gòu)建抗蟲植以及應(yīng)用至ｌｊ醫(yī)藥行業(yè)等》逡逑

行更多的處理。逡逑數(shù)據(jù)量是衡量測(cè)序質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一＊只有Ｓ數(shù)據(jù)量足夠才能檢測(cè)到表達(dá)量較低的逡逑轉(zhuǎn)錄本＾圖３．１Ｃ是過濾前后序列數(shù)量的對(duì)比，其中灰色代表過濾前，黑色代表過濾后，逡逑所有樣本過濾后的序列數(shù)均在２３Ｍ以上ｐ家蠶的基因組相對(duì)人類的基０組來說比較小，逡逑因此不需要達(dá)到３０Ｍ的測(cè)序深度，目前的測(cè)序深度己經(jīng)能夠用于檢測(cè)低表達(dá)f埖淖煎義媳盡ｅ義顯詒Ｖな萘砍渥愕耐�，粍庤要保证矎T虻鬧柿浚嵬跡常保氖鞘菰ご硨�，所辶x嫌醒局行蛄兄柿康姆植記榭�。从唾Z鋅梢鑰闖觶硨笏行蛄械鈉驕柿糠植季義顯冢常耙隕希�，属釉嵾质量数舅|蛄械那安扛蟛康牟廡蛑柿拷系汀Ｕ饈遣廡蚴葜繡義銑＜南窒�，抠犥与序列前部的碱基分布波动较大有关，并矒Q岫院笮治霾跋歟掊義弦虼宋吮Ｖば蛄杏瀉鮮實(shí)某ざ齲輝俁孕蛄薪薪囟獺ｅ義希常玻彩蕕奶卣麇義希鈴危洛義希保埃埃義希穡澹蟈澹螅澹瘢酰澹睿悖邋澹牽緬澹悖錚睿簦澹睿翦義

本文編號(hào)：2756416