【摘要】：病毒入侵宿主細胞后,天然免疫系統(tǒng)隨即被激活,進而啟動抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)。2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶(2'-5'-O1igoadenylate synthetase,OAS)家族蛋白以其能夠激活RNase L介導的病毒RNA降解通路,在天然免疫中發(fā)揮著重要的作用。在后生動物中,OAS基因可以分為OAS1、OAS2、OAS3和OASL四個超家族,OASL(OAS-like)基因作為OAS家族的非典型成員(OASL蛋白C端包含兩個串聯(lián)的UBL結(jié)構(gòu)域),在哺乳動物中存在OAS酶活性的差異,而OAS酶活性的差異導致哺乳動物OASL蛋白在激活OAS/RNase L和OASL/RIG-I通路發(fā)揮抗病毒活性的差異。與哺乳類相比,大多數(shù)鳥類(如雞和鴨等突胸目)OAS基因家族成員單一,只存在OASL一個成員;在平胸目鳥類(如鴕鳥和白喉(?)中,除具有OASL外,OAS1基因也被保留了下來。目前,關(guān)于鳥類OASL基因功能研究鮮有報道。首先對不同鳥類(鴨和鴕鳥)OASL蛋白的抗病毒活性進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是高致病性(A/duck/Hubei/49/05)還是低致病性(A/goose/Hubei/65/05)H5N1禽流感病毒在穩(wěn)定過表達鴨OASL的DF1細胞中的復制都顯著降低(P0.05),鴨OASL對這兩株流感病毒的抑制作用與鴨RIG-Ⅰ相當;進一步利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得OASL敲除的DF1細胞系(DF1OASL-/-),結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨和鴕鳥OASL(dOASL和oOASL)都能顯著抑制另外一株H5N1禽流感病毒(A/chicken/huabei/0513/2007)在細胞中的增殖,并且該毒株在DF1OASL-/-細胞中的復制顯著增加(P0.05);此外,鴨和鴕鳥OASL都能顯著抑制另外一株單股負鏈RNA病毒(NDV/LaSota)和兩株雙鏈RNA病毒(IBDV/B87和REOV/Z97/C10)在細胞中的增殖,并且這些病毒在DF1OASL-/-細胞中的復制顯著增加(P0.05);鴨OASL還能夠抑制單股正鏈RNA病毒(O/BY/CHA/2010)在IBRS2細胞中的增殖(P0.05);然而,無論是鴨還是鴕鳥OASL對兩株DNA病毒(FPV/CVCC/AV1003和PRV/Henan/2014)在細胞中的復制都沒有顯著影響。以上研究表明,鳥類OASL能夠廣泛抑制多種RNA病毒的增殖,對DNA病毒的復制沒有顯著影響,這與某些哺乳類OASLs的抗病毒活性相似。接下來,對鴨和鴕鳥OASL蛋白的OAS酶活性進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與小鼠Oasl2(mOas12)相似,鴨和鴕鳥OASL都具有OAS酶活性,并且能有效激活RNase L;進一步研究發(fā)現(xiàn),鳥類和哺乳類OASL蛋白(dOASL、oOASL、hOASL和mOasl2)利用其自身3個天冬氨酸(同源于人OAS1蛋白Asp75-Asp77-Asp148)的突變可逆的開啟或關(guān)閉RNase L通路;同時具有OAS 酶活性的OASL蛋白能夠顯著上調(diào)RNaseL和多個干擾素通路相關(guān)基因(如IFNα、IFNβ、STAT1和MX1等)的表達(P0.05);對OASL蛋白不同結(jié)構(gòu)域截短體的研究發(fā)現(xiàn),鳥類和哺乳類OASL激活RNase L通路具有UBL結(jié)構(gòu)域的依賴性差異,與哺乳類不同,鳥類OASL蛋白發(fā)揮有效的OAS酶活性依賴其UBL結(jié)構(gòu)域?qū)sRNA的結(jié)合作用,從而協(xié)同其OLD結(jié)構(gòu)域激活并放大RNase L通路發(fā)揮抗病毒活性。本研究還發(fā)現(xiàn),失去OAS酶活性的鴨和鴕鳥OASL-3D*突變體能夠放大RIG-I信號,這與人OASL和小鼠Oasl2-3D*的研究相一致;相比較而言,同樣失去OAS酶活性的鴨OASL-3K*和人OASL-R*K*K*突變體對RIG-I信號都沒有放大作用,因此OAS酶活性失活是鳥類和哺乳類OASL蛋白放大RIG-I信號的必要不充分條件;另外,與人和小鼠相似,鴨OASL與鴨RIG-I蛋白存在互作,并且它們之間的相互作用不受自身3個天冬氨酸(同源于人OAS1蛋白Asp75-Asp77-Asp148)突變的影響,也不依賴于病毒的誘導,OLD結(jié)構(gòu)域為OASL和RIG-Ⅰ互作的核心結(jié)構(gòu)域;無論是鳥類還是哺乳類OASL對RIG-Ⅰ信號的放大作用都依賴其完整的UBL結(jié)構(gòu)域。此外,與小鼠Oasl1不同,鴨OASL蛋白與鴨IRF7基因的5'UTR區(qū)不存在結(jié)合作用;同時鳥類可能不存在MBD1基因,因此鳥類不存在與人相似的OASL-MBD1直接互作機制。綜上所述,本研究闡明了由鳥類和哺乳類OASL蛋白介導調(diào)控的OAS/RNase L和OASL/RIG-Ⅰ通路的分子交流機制。這些結(jié)果為鳥類和哺乳類OASL基因在流感等RNA病毒抗病中的深入研究提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q939.4
【圖文】：

學位論文．，邋２０１４）。Ａ型流感病毒還是引發(fā)人畜共患病的重要病原體，一及近年來流行的Ｈ７和Ｈ６等亞型，不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟脅（Ｈａｒｆｏｏｔ邋ａｎｄ邋Ｗｅｂｂｙ，２０１７）�？偠灾�，Ａ型流感病毒可以感重，而且給人類健康帶來重大威脅。逡逑毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)逡逑毒顆粒呈球形或多形性，直徑８０￣１２０邋ｎｍ，由外而內(nèi)共有三邋Ｗｅｂｓｔｅｒ邋ｅｔａｌ．，邋１９９２）。最外層為來源于宿主細胞的雙層類脂囊，中ＨＡ分子為三聚體構(gòu)成的棒狀纖突，ＮＡ分子為四聚體構(gòu)成的蘑隙中還分布有少量基質(zhì)蛋白（Ｍ２）構(gòu)成的突起；中間層是由基的形態(tài)結(jié)構(gòu)；最里層由８條單股負鏈ＲＮＡ及核蛋白（ＮＰ）纏繞個聚合酶蛋白（？８２、卩８１和？六）組成（圖卜１）（８0仍＾以１１（１？也５蛋白質(zhì)，約占病毒總重的７０％；邋ＲＮＡ占１％；糖類占５°／ｗ８％；脂膜上的脂類相似（Ｗｅｂｓｔｅｒｅｔａｌ．，邋１９９２）。逡逑Ｌｉｐｉｄ邋ｅｎｖｅｌｏｐｅ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋－逡逑ｆｒｏｍ邋ｈｏｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邐？逡逑

Ｍ２逡逑Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｏｍｐｌｅｘ逡逑圖１－１邋Ａ型流感病毒的結(jié)構(gòu)模式圖（Ｍｅｄｉｎａ邋ａｎｄ邋Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ，邋２０１１＞逡逑１．２．２流感病毒基因組及其編碼的蛋白逡逑１．２．２．１流感病毒基因組核酸特征逡逑流感病毒基因組由多個分節(jié)段的線性單股負鏈ＲＮＡ組成：Ａ型和Ｂ型流感病毒均包含８個節(jié)段，逡逑Ｃ型流感病毒包含７個節(jié)段；丨ＡＶ基因組核酸片段總長度為１３邋５８８邋ｎｔ邋（Ｂｏｕｖｉｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）。Ａ型流感逡逑病毒ＲＮＡ節(jié)段的５＇和３味端序列保守并部分互補，其５＇末端序列為ＡＧＵＡＧＡＡＡＣＡＧＧ，３味端保逡逑守序歹｜Ｊ為ＵＣＧ（Ｕ／Ｃ）ＵＵＩＪＣＧＵＣＣ；邋Ｂ型流感病毒ＲＮＡ的５＇端序歹ｉｊ為ＡＧＵＡＧ（Ａ／Ｕ）ＡＡＣＡＡ，３１端保逡逑守序列為ＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣ；邋Ｃ型流感病毒ＲＮＡ的５瑞保守序列為ＡＧＣＡＧ（Ｕ／Ｇ）ＡＧＣＡＡＧｙ端保守逡逑序列為ＵＣＧＵＣＵＵＣＧＵＣ，以上這些序列具有啟動子活性。在一些缺陷型病毒粒子中存在相對較逡逑短的ＲＮＡ節(jié)段。逡逑１．２．２．２流感病毒編碼的蛋白及功能逡逑１ＡＶ共包含８個線狀單股負鏈ＲＮＡ節(jié)段，可編碼至少１０種蛋白（Ｍｅｄｉｎａ邋ａｎｄ邋Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ，逡逑２０１１），包括ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍｌ、Ｍ２以及非結(jié)構(gòu)蛋白ＮＳ１邋和ＮＳ２（圖邋１－１）；除此之逡逑夕卜

病毒基因組及Ｍｌ蛋白結(jié)合，介導ｖＲＮＰ的出核（Ｎｅｕｍａｎｎ邋ｅｔａｌ．，２０００）。逡逑１．２．２．３流感病毒編碼的新蛋白逡逑由尸５／基因編碼的兩個新蛋白１＾１＋２和ＰＢ１－Ｎ４０邋（圖１－３）。ＰＢ１－Ｆ２蛋白主要位于在線粒體上，逡逑與促凋亡和促炎癥效應(yīng)相關(guān)，ＰＢ１－Ｆ２蛋白同時具有核定位信號，能夠與ＰＢ１互作而增強聚合酶的逡逑活性，另外ＰＢ１－Ｆ２也參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)（Ｃｏｎｅｎｅｌｌｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１；邋Ｃｏｎｅｎｅｌｌｏ邋ａｎｄ邋Ｐａｌｅｓｅ，邋２００７；逡逑Ｄｕｄｅｋ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ｚａｍａｒｉｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００５）；邋ＰＢ１－Ｎ４０能夠與ＰＢ２互作，影響聚合酶反應(yīng)，同時ＰＢ１－Ｎ４０逡逑影響病毒的增殖效率（Ｔａｕｂｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．

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本文編號：2755394