【摘要】：翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)是一類廣泛存在于真核生物中參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的大家族,在響應(yīng)生物和非生物脅迫中均扮演著重要的角色。TCTP的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的調(diào)控,而啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。目前,關(guān)于TCTP的研究主要集中在人類和動(dòng)物體中,對(duì)植物TCTP的結(jié)構(gòu)和功能的報(bào)道相對(duì)較少,對(duì)其啟動(dòng)子的研究更是知之甚少。在本試驗(yàn)中,以黃瓜品系B21-a-2-1-2作為材料,結(jié)合生物信息學(xué)和瞬時(shí)表達(dá)分析等技術(shù)對(duì)黃瓜CsTCTPs啟動(dòng)子進(jìn)行了分離和表征,明確該基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到多種順式作用元件的調(diào)控,為進(jìn)一步探索CsTCTPs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制提供依據(jù),同時(shí),對(duì)深入了解植物的抗逆性具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:(1)利用常規(guī)PCR技術(shù)成功地從黃瓜基因組DNA中分離獲得了CsTCTP1和CsTCTP2的啟動(dòng)子序列,并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了CsTCTP1(-1308 bp到+88 bp)和CsTCTP2(-1305 bp到+69 bp)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的分布及功能。結(jié)果表明,CsTCTPs啟動(dòng)子區(qū)均含有保守的TATA-box、CAAT-box等核心啟動(dòng)子元件,以及上游的多種順式作用元件,如激素應(yīng)答元件(ABRE、TCA和ERE等)、逆境脅迫應(yīng)答元件(TC-rich repeats)和光應(yīng)答元件(G-box)等。(2)根據(jù)作用元件在CsTCTP1和CsTCTP2啟動(dòng)子上的位置,分別獲得六個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺失片段,即:proT1-1.3kb(-1308 bp~+88 bp)、proT1-0.7kb(-714 bp~+88 bp)、proT1-0.3kb(-306 bp~+88 bp)、proT2-1.3kb(-1305 bp~+69 bp)、proT2-0.7kb(-732 bp~+69 bp)、proT2-0.3kb(-324 bp~+69 bp)。(3)利用各個(gè)啟動(dòng)子缺失體替換pCAMBIA 1301中的35S啟動(dòng)子,成功構(gòu)建了載有各個(gè)啟動(dòng)子缺失片段的GUS融合載體proT1-1.3kb-GUS、proT1-0.7kb-GUS、proT1-0.3kb-GUS、proT2-1.3kb-GUS、proT2-0.7kb-GUS、proT2-0.3kb-GUS。(4)將構(gòu)建成功的六個(gè)GUS融合載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中。利用農(nóng)桿菌注射滲透法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草,并進(jìn)行組織化學(xué)染色和熒光GUS定量測(cè)定。結(jié)果表明:CsTCTP1和CsTCTP2的六個(gè)啟動(dòng)子缺失片段都具有啟動(dòng)基因表達(dá)的功能,并且活性約為35S啟動(dòng)子的3~4倍,其中proT1-0.7kb的活性最強(qiáng),推測(cè)該序列中含有類似增強(qiáng)子的順式作用元件;而其他啟動(dòng)子序列具有的功能并不明確,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。(5)分別使用不同的外源激素(ABA、SA和ETH)對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后的煙草葉片進(jìn)行處理,24 h后測(cè)定啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明,在ABA處理組中,CsTCTP1的proT1-0.7kb和CsTCTP2的proT2-1.3kb啟動(dòng)子活性均上調(diào),推測(cè)該啟動(dòng)子序列中可能含有ABA相關(guān)的響應(yīng)元件;SA和ETH處理組中,CsTCTP1和CsTCTP2的所有啟動(dòng)子片段的活性都有不同程度下降,因此推測(cè)SA和ETH可能對(duì)CsTCTP1和CsTCTP2啟動(dòng)子均具有負(fù)調(diào)控的作用。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S642.2
【圖文】：

如 CAAT-box、GC-box 等（李崢 2012；Smale et al. 2003）（圖1-1）。圖 1-1 真核生物基因上游序列Fig.1-1 upstream sequence of Eukaryotic gene

膠電泳對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，切割目的片段并回膠回收收試劑盒（康為）對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收，具體步 溶液保存于-20 ℃ 冰箱待用。分析查找黃瓜 CsTCTP1（Loc101204913）和 CsTCTP2在 CDS 序列（或 ATG）上游約 2000 bp 的堿基序列利用在線軟件 BDGP、TSSP 和 PlantCARE 對(duì) CsTC所含的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。因組 DNA 的提取-1-2）葉片基因組 DNA 提取后用 1% 瓊脂糖凝膠電示提取的黃瓜基因組 DNA 可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2-2 CsTCTP1 和 CsTCTP2 啟動(dòng)子片段克隆結(jié)果：DL5000 DNA marker；1：CsTCTP1 promoter；2：CsTCTP2 prom Amplification results of CsTCTP1 and CsTCTP2 promoter f(M: DL5000 DNAmarker; 1: CsTCTP1 promoter; 2: CsTCTP2 promote4080.C.G.T.G.T.A.G.T.G.A.T.A.T.A.A.A.CaAAgGGaAAgGGtTTcCCaAAaAAtTTtTTaAAaAAtTTcCCaAAtTTaAAcCCtTTtTTaAAtTTaAAgGGgGGaAAaAAaAAaAAtTTcCCtTTaAAcCCcCCtTTtTTtTTaAAtTT120160tTTgGGtTTtTTtTTtTTgGGtTTaAAaAAtTTtTTaAAgGGtTTtTTaAAtTTcCCtTTaAAaAAtTTcCCtTTcCCcCCcCCcCCtTTtTTtTTtTTgGGcCCtTTtTTtTTtTTgGGaAAaAAcCCtTTtTTaAAgGGtTTtTTgGGaAAcCCgGGtTTtTTgGGaAA200240aAAaAAgGGgGGtTTgGGaAAgGGaAAaAAcCCgGGaAAaAAgGGtTTtTTtTTtTTgGGtTTtTTgGGtTTtTTtTTaAAtTTgGG

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本文編號(hào)：2754448