【摘要】：目的:睪丸作為雄性哺乳動物的生殖器官,具有產(chǎn)生成熟精子、分泌雄性激素的功能,從出生至成年要經(jīng)歷復雜而漫長的發(fā)育過程。雄性的精子發(fā)生起源于精原干細胞(spermatogenial stem cells,SSCs),這類細胞擁有三種不同的命運:(1)維持干細胞特性的精原干細胞,是雄性生殖能力的保障;(2)通過凋亡清除發(fā)育異常的生精細胞,以保證生精細胞質(zhì)量;(3)經(jīng)有絲分裂發(fā)育為精原祖細胞(spermatogonial progenitors——A_s,A_(pr),A_(al):A_(al4),A_(al8),A_(al16)),精原祖細胞在經(jīng)歷A型(A_1,A_2,A_3,A_4)、中間型以及B型精原細胞的有絲分裂發(fā)育并完成染色質(zhì)復制后便可進入配子發(fā)生的程序——減數(shù)分裂。減數(shù)分裂期聯(lián)會復合體的形成為同源染色體之間進行同源重組、遺傳信息交換提供結(jié)構(gòu)支撐,同源染色體間若無聯(lián)會復合體減數(shù)分裂停滯。減數(shù)分裂之后是精子形成期,精子細胞在這一時期經(jīng)歷一系列的結(jié)構(gòu)重塑和形態(tài)變化之后形成成熟精子。精子發(fā)生復雜而漫長的發(fā)育過程受一系列按時空順序表達的特定基因影響,任何發(fā)育過程停滯都會導致雄性不育,因此,生殖細胞特異表達轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控一系列特定基因程序性表達在精子發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。精卵發(fā)生特異表達螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(spermatogenesis-and oogenesis-specific helix-loop-helix transcription factor 1,Sohlh1)是生殖細胞特異表達轉(zhuǎn)錄因子,屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,該基因位于小鼠的第2號染色體及人的第9號染色體上。SOHLH1在雄性小鼠體內(nèi)主要表達于A_(al)~B型精原細胞,在精子發(fā)生中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因表達發(fā)揮重要作用。通過對不同地區(qū)、不同民族的男性非梗阻性無精子癥(Nonobstructive azoospermia,NOA)患者基因突變篩查,發(fā)現(xiàn)SOHLH1基因不同位點發(fā)生非同義突變。NOA為睪丸生精功能障礙,臨床表現(xiàn)為男性不育,嚴重影響個人生活質(zhì)量、人類遺傳信息多樣性。因此許多學者將SOHLH1基因視為導致男性不育的候選基因,探討該基因在人類精子發(fā)生中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Sohlh1基因敲除(Sohlh1 knockout,KO)小鼠在有絲分裂期異常發(fā)育的精原細胞并未凋亡,部分精原細胞可提前進入減數(shù)分裂繼續(xù)發(fā)育,在減數(shù)分裂階段精母細胞發(fā)生大量凋亡,精子發(fā)生失敗、小鼠不育。目前關(guān)于Sohlh1敲除小鼠精原細胞發(fā)育異常的分子機制尚不十分清楚,Sohlh1敲除小鼠精母細胞發(fā)育是否受到影響也有待于深入研究。本研究旨在通過一系列形態(tài)學和組織學觀察方法,分析Sohlh1基因缺失對小鼠和精母細胞減數(shù)分裂發(fā)育的影響,通過芯片分析篩選Sohlh1敲除雄性小鼠差異表達基因;并通過Western Blot、免疫熒光和透射電鏡等系列實驗進一步分析SOHLH1在精母細胞發(fā)育過程中的作用,探討該轉(zhuǎn)錄因子是否能直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控聯(lián)會復合體蛋白編碼基因Sycp1和Sycp3,闡明SOHLH1對雄性小鼠精母細胞發(fā)育的影響及其機制,為充分了解由于SOHLH1突變導致男性患者不育的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。研究方法:本研究以Sohlh1基因敲除雄鼠與野生型C57BL/6J雄鼠為研究對象,對比分析PD7.5(出生后7.5天)、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5小鼠外觀和睪丸發(fā)育、精子發(fā)生等指標的變化情況;利用芯片分析PD7.5小鼠睪丸差異表達基因;選取PD14.5小鼠睪丸為研究對象,檢測小鼠睪丸中聯(lián)會復合體蛋白表達變化,利用透射電鏡觀察精母細胞中聯(lián)會復合體形成情況;選取PD14.5野生型雄鼠睪丸作為觀察對象,對SOHLH1蛋白與SYCP3蛋白進行共定位分析;通過構(gòu)建Sycp1和Sycp3啟動子表達載體,利用雙熒光素酶報告基因研究SOHLH1蛋白對Sycp1和Sycp3啟動子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性;利用ChIP實驗尋找SOHLH1在Sycp1和Sycp3啟動子序列上的結(jié)合位點。結(jié)果:1、形態(tài)觀察結(jié)果表明,與野生型(WT)C57BL/6J相比,各階段(PD7.5、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5)Sohlh1敲除(KO)雄鼠外觀并未出現(xiàn)異常,而睪丸自出生后第14.5天開始發(fā)育遲緩,并在此后(PD23.5、PD49.5)處于維持階段。組織學觀察結(jié)果表明,各階段(PD7.5、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5)WT小鼠生精細胞正常發(fā)育,Sohlh1 KO小鼠生精細胞自出生后10.5天開始出現(xiàn)差異,曲細精管內(nèi)精母細胞數(shù)減少,出生后14.5天時未見粗線期、雙線期精母細胞,出生后23.5天、49.5天未見粗線期、雙線期精母細胞及以后各階段生精細胞。Sohlh1基因影響睪丸發(fā)育主要是通過阻礙細線期、偶線期精母細胞向粗線期、雙線期發(fā)育實現(xiàn)的。2、在Sohlh1基因敲除小鼠出生后7.5天睪丸中,有205個差異表達基因,47.6%(66個)基因表達上調(diào),67.8%(139個)基因表達下調(diào)。下調(diào)基因包括減數(shù)分裂、信號通路及生殖發(fā)育相關(guān)因子。3、Real-time PCR結(jié)果顯示Sohlh1基因缺失聯(lián)會復合體蛋白因子Sycp1和Sycp3以及減數(shù)分裂相關(guān)因子Tex11表達顯著下調(diào),在出生后14.5天時,由于Sohlh1基因缺失,SYCP1蛋白和SYCP3蛋白表達顯著下調(diào),透射電鏡觀察精母細胞核中未見聯(lián)會復合體結(jié)構(gòu),染色體聯(lián)會異常,免疫熒光結(jié)果顯示SOHLH1蛋白與SYCP3蛋白表達存在相關(guān)性,提示Sohlh1基因可能影響減數(shù)分裂過程中聯(lián)會復合體形成從而影響精母細胞發(fā)育。4、利用雙熒光素酶報告基因證實,當真核表達載體SOHLH1存在時,Sycp1和Sycp3熒光表達載體熒光值增強,提示轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對聯(lián)會復合體蛋白基因Sycp1和Sycp3表達具有轉(zhuǎn)錄激活作用。當突變Sycp1-249bp~84bp區(qū)域單個E-box結(jié)構(gòu)域(-45bp、-94bp)或兩個E-box結(jié)構(gòu)域都突變時,SOHLH1對Sycp1的轉(zhuǎn)錄激活作用消失;當Sycp3-286bp~66bp區(qū)域-43bp E-box結(jié)構(gòu)域突變時,SOHLH1對Sycp3的轉(zhuǎn)錄激活作用并未消失,而Sycp3-286bp~66bp區(qū)域-64bp E-box結(jié)構(gòu)域突變或-43bp、-64bp兩個E-box結(jié)構(gòu)域都突變時,SOHLH1對Sycp3的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著下降但并未徹底消失。結(jié)果顯示SOHLH1可通過Sycp1和Sycp3基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游E-box結(jié)構(gòu)域?qū)ycp1和Sycp3基因起轉(zhuǎn)錄激活作用。5、在小鼠睪丸中,轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1能夠結(jié)合于Sycp1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1276bp、-708bp和-94bp E-box結(jié)構(gòu)域,能夠結(jié)合于Sycp3轉(zhuǎn)錄起始位點上游-64bp和-43bp E-box結(jié)構(gòu)域。結(jié)論:1、Sohlh1基因缺失小鼠精母細胞發(fā)育阻滯在減數(shù)分裂期。2、減數(shù)分裂相關(guān)基因Sycp1和Sycp3是Sohlh1基因敲除小鼠精母細胞發(fā)育阻滯的重要候選基因。3、Sohlh1基因缺失小鼠精母細胞聯(lián)會復合體異常,染色體無法形成聯(lián)會。4、Sohlh1基因缺失小鼠聯(lián)會復合體蛋白SYCP1和SYCP3表達顯著下調(diào),SOHLH1蛋白與SYCP3蛋白在出生后14.5天小鼠睪丸組織中共表達。4、雙熒光素酶報告基因證實,轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對聯(lián)會復合體蛋白基因Sycp1和Sycp3表達具有轉(zhuǎn)錄激活作用。5、在小鼠睪丸中,轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1能夠結(jié)合于Sycp1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1276bp、-708bp和-94bp E-box結(jié)構(gòu)域,對Sycp1具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;能夠結(jié)合于Sycp3轉(zhuǎn)錄起始位點上游-64bp和-43bp E-box結(jié)構(gòu)域,通過-64bp E-box結(jié)構(gòu)域?qū)ycp3具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;Q23
【圖文】：

圖 2.1 技術(shù)路線圖2.3 實驗方法2.3.1 Sohlh1 KO 與 WT 小鼠基因型鑒定取 7.5d 雄鼠鼠尾，約 0.5cm 長，置于 1.5mL 離心管中，加入 500μL 鼠尾消化液（NaCl 2.93g,SDS 2.5g,1M Tris-HCl pH8.0 5mL,0.5M EDTApH8.0 10mL 定容至 500mL）和 5μL 蛋白酶 K，55°C 水浴鍋中消化過夜，加入 500μL 苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），上下顛倒 15 次混勻，12000g 離心 10min。小心取出離心管吸取 380μL 上清液至新 1.5mL 離心管中，加入等體積異丙醇后上下顛倒 15 次至出現(xiàn)白色絮狀物沉淀，12000g 離心 10min。棄上清后加入 500μL75%酒精，輕彈管底將使白色沉淀懸浮，12000g離心10min。棄上清，室溫晾干后加入40μLddH2O溶解 DNA 過夜，4°C 保存。分別用基因鑒定引物以提取鼠尾 DNA 為模板，PCR擴增目的片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段拍照。

3 結(jié)果 KO 與 WT 小鼠基因型鑒定hlh1-KO 引物獲得的 PCR 產(chǎn)物為基因敲除打靶載體中DNA 片段；使用 Sohlh1-WT 引物獲得的 PCR 產(chǎn)物為DNA 片段�？筛鶕�(jù)兩對引物擴增產(chǎn)物鑒定小鼠基因型除小鼠的基因組部分外顯子被打靶載體序列所取物 PCR 擴增后電泳產(chǎn)物僅可見 Sohlh1-KO 引物 PCR一個等位基因含有 Sohlh1 全部外顯子，另一等位基 PCR 后產(chǎn)物既有 Sohlh1-WT 引物擴增產(chǎn)物又有 Soh型小鼠基因組中無打靶載體序列插入，無外顯子被敲物擴增產(chǎn)物。

圖 3.2 不同階段小鼠外觀及睪丸外觀觀察A、B 分別為 PD7.5 WT 和 KO 雄鼠外觀，未見明顯差異；C、D 分別為 PD10.5 WT 和KO 雄鼠外觀，未見明顯差異；I、J 分別為 PD14.5 WT 和 KO 雄鼠外觀，未見明顯差異；K、L 分別為 PD23.5 WT 和 KO 雄鼠外觀，未見明顯差異；Q、R 分別為 PD49.5 WT 和 KO 雄鼠外觀，未見明顯差異；E、F 分別為 PD7.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀，未見明顯差異；G、H分別為 PD10.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀，未見明顯差異；M、N 分別為 PD14.5 WT 和 KO雄鼠睪丸外觀，未見明顯差異；O、P 分別為 PD23.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀，KO 睪丸明顯小于 WT；S、T 分別為 PD49.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀，KO 睪丸明顯小于 WT。3.3 不同階段小鼠睪丸組織切片 HE 觀察成年小鼠睪丸曲細精管中存在各期生精細胞，其形態(tài)如圖 3.3 所示。HE 染色 A 型精原細胞核體積較小，染色較淺，核膜內(nèi)側(cè)可見深染染色質(zhì)（圖 3.3A）；中間型和 B 型精原細胞與 A 型精原細胞相似，但核膜內(nèi)側(cè)深染染色質(zhì)數(shù)目增多

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4 葉楠;g墻

本文編號：2751728