【摘要】：目的:睪丸作為雄性哺乳動(dòng)物的生殖器官,具有產(chǎn)生成熟精子、分泌雄性激素的功能,從出生至成年要經(jīng)歷復(fù)雜而漫長(zhǎng)的發(fā)育過(guò)程。雄性的精子發(fā)生起源于精原干細(xì)胞(spermatogenial stem cells,SSCs),這類(lèi)細(xì)胞擁有三種不同的命運(yùn):(1)維持干細(xì)胞特性的精原干細(xì)胞,是雄性生殖能力的保障;(2)通過(guò)凋亡清除發(fā)育異常的生精細(xì)胞,以保證生精細(xì)胞質(zhì)量;(3)經(jīng)有絲分裂發(fā)育為精原祖細(xì)胞(spermatogonial progenitors——A_s,A_(pr),A_(al):A_(al4),A_(al8),A_(al16)),精原祖細(xì)胞在經(jīng)歷A型(A_1,A_2,A_3,A_4)、中間型以及B型精原細(xì)胞的有絲分裂發(fā)育并完成染色質(zhì)復(fù)制后便可進(jìn)入配子發(fā)生的程序——減數(shù)分裂。減數(shù)分裂期聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成為同源染色體之間進(jìn)行同源重組、遺傳信息交換提供結(jié)構(gòu)支撐,同源染色體間若無(wú)聯(lián)會(huì)復(fù)合體減數(shù)分裂停滯。減數(shù)分裂之后是精子形成期,精子細(xì)胞在這一時(shí)期經(jīng)歷一系列的結(jié)構(gòu)重塑和形態(tài)變化之后形成成熟精子。精子發(fā)生復(fù)雜而漫長(zhǎng)的發(fā)育過(guò)程受一系列按時(shí)空順序表達(dá)的特定基因影響,任何發(fā)育過(guò)程停滯都會(huì)導(dǎo)致雄性不育,因此,生殖細(xì)胞特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控一系列特定基因程序性表達(dá)在精子發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。精卵發(fā)生特異表達(dá)螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(spermatogenesis-and oogenesis-specific helix-loop-helix transcription factor 1,Sohlh1)是生殖細(xì)胞特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子,屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,該基因位于小鼠的第2號(hào)染色體及人的第9號(hào)染色體上。SOHLH1在雄性小鼠體內(nèi)主要表達(dá)于A(yíng)_(al)~B型精原細(xì)胞,在精子發(fā)生中通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因表達(dá)發(fā)揮重要作用。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)、不同民族的男性非梗阻性無(wú)精子癥(Nonobstructive azoospermia,NOA)患者基因突變篩查,發(fā)現(xiàn)SOHLH1基因不同位點(diǎn)發(fā)生非同義突變。NOA為睪丸生精功能障礙,臨床表現(xiàn)為男性不育,嚴(yán)重影響個(gè)人生活質(zhì)量、人類(lèi)遺傳信息多樣性。因此許多學(xué)者將SOHLH1基因視為導(dǎo)致男性不育的候選基因,探討該基因在人類(lèi)精子發(fā)生中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Sohlh1基因敲除(Sohlh1 knockout,KO)小鼠在有絲分裂期異常發(fā)育的精原細(xì)胞并未凋亡,部分精原細(xì)胞可提前進(jìn)入減數(shù)分裂繼續(xù)發(fā)育,在減數(shù)分裂階段精母細(xì)胞發(fā)生大量凋亡,精子發(fā)生失敗、小鼠不育。目前關(guān)于Sohlh1敲除小鼠精原細(xì)胞發(fā)育異常的分子機(jī)制尚不十分清楚,Sohlh1敲除小鼠精母細(xì)胞發(fā)育是否受到影響也有待于深入研究。本研究旨在通過(guò)一系列形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀(guān)察方法,分析Sohlh1基因缺失對(duì)小鼠和精母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)育的影響,通過(guò)芯片分析篩選Sohlh1敲除雄性小鼠差異表達(dá)基因;并通過(guò)Western Blot、免疫熒光和透射電鏡等系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析SOHLH1在精母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的作用,探討該轉(zhuǎn)錄因子是否能直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白編碼基因Sycp1和Sycp3,闡明SOHLH1對(duì)雄性小鼠精母細(xì)胞發(fā)育的影響及其機(jī)制,為充分了解由于SOHLH1突變導(dǎo)致男性患者不育的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。研究方法:本研究以Sohlh1基因敲除雄鼠與野生型C57BL/6J雄鼠為研究對(duì)象,對(duì)比分析PD7.5(出生后7.5天)、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5小鼠外觀(guān)和睪丸發(fā)育、精子發(fā)生等指標(biāo)的變化情況;利用芯片分析PD7.5小鼠睪丸差異表達(dá)基因;選取PD14.5小鼠睪丸為研究對(duì)象,檢測(cè)小鼠睪丸中聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白表達(dá)變化,利用透射電鏡觀(guān)察精母細(xì)胞中聯(lián)會(huì)復(fù)合體形成情況;選取PD14.5野生型雄鼠睪丸作為觀(guān)察對(duì)象,對(duì)SOHLH1蛋白與SYCP3蛋白進(jìn)行共定位分析;通過(guò)構(gòu)建Sycp1和Sycp3啟動(dòng)子表達(dá)載體,利用雙熒光素酶報(bào)告基因研究SOHLH1蛋白對(duì)Sycp1和Sycp3啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性;利用ChIP實(shí)驗(yàn)尋找SOHLH1在Sycp1和Sycp3啟動(dòng)子序列上的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果:1、形態(tài)觀(guān)察結(jié)果表明,與野生型(WT)C57BL/6J相比,各階段(PD7.5、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5)Sohlh1敲除(KO)雄鼠外觀(guān)并未出現(xiàn)異常,而睪丸自出生后第14.5天開(kāi)始發(fā)育遲緩,并在此后(PD23.5、PD49.5)處于維持階段。組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果表明,各階段(PD7.5、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5)WT小鼠生精細(xì)胞正常發(fā)育,Sohlh1 KO小鼠生精細(xì)胞自出生后10.5天開(kāi)始出現(xiàn)差異,曲細(xì)精管內(nèi)精母細(xì)胞數(shù)減少,出生后14.5天時(shí)未見(jiàn)粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期精母細(xì)胞,出生后23.5天、49.5天未見(jiàn)粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期精母細(xì)胞及以后各階段生精細(xì)胞。Sohlh1基因影響睪丸發(fā)育主要是通過(guò)阻礙細(xì)線(xiàn)期、偶線(xiàn)期精母細(xì)胞向粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期發(fā)育實(shí)現(xiàn)的。2、在Sohlh1基因敲除小鼠出生后7.5天睪丸中,有205個(gè)差異表達(dá)基因,47.6%(66個(gè))基因表達(dá)上調(diào),67.8%(139個(gè))基因表達(dá)下調(diào)。下調(diào)基因包括減數(shù)分裂、信號(hào)通路及生殖發(fā)育相關(guān)因子。3、Real-time PCR結(jié)果顯示Sohlh1基因缺失聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白因子Sycp1和Sycp3以及減數(shù)分裂相關(guān)因子Tex11表達(dá)顯著下調(diào),在出生后14.5天時(shí),由于Sohlh1基因缺失,SYCP1蛋白和SYCP3蛋白表達(dá)顯著下調(diào),透射電鏡觀(guān)察精母細(xì)胞核中未見(jiàn)聯(lián)會(huì)復(fù)合體結(jié)構(gòu),染色體聯(lián)會(huì)異常,免疫熒光結(jié)果顯示SOHLH1蛋白與SYCP3蛋白表達(dá)存在相關(guān)性,提示Sohlh1基因可能影響減數(shù)分裂過(guò)程中聯(lián)會(huì)復(fù)合體形成從而影響精母細(xì)胞發(fā)育。4、利用雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí),當(dāng)真核表達(dá)載體SOHLH1存在時(shí),Sycp1和Sycp3熒光表達(dá)載體熒光值增強(qiáng),提示轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對(duì)聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白基因Sycp1和Sycp3表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄激活作用。當(dāng)突變Sycp1-249bp~84bp區(qū)域單個(gè)E-box結(jié)構(gòu)域(-45bp、-94bp)或兩個(gè)E-box結(jié)構(gòu)域都突變時(shí),SOHLH1對(duì)Sycp1的轉(zhuǎn)錄激活作用消失;當(dāng)Sycp3-286bp~66bp區(qū)域-43bp E-box結(jié)構(gòu)域突變時(shí),SOHLH1對(duì)Sycp3的轉(zhuǎn)錄激活作用并未消失,而Sycp3-286bp~66bp區(qū)域-64bp E-box結(jié)構(gòu)域突變或-43bp、-64bp兩個(gè)E-box結(jié)構(gòu)域都突變時(shí),SOHLH1對(duì)Sycp3的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著下降但并未徹底消失。結(jié)果顯示SOHLH1可通過(guò)Sycp1和Sycp3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游E-box結(jié)構(gòu)域?qū)ycp1和Sycp3基因起轉(zhuǎn)錄激活作用。5、在小鼠睪丸中,轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1能夠結(jié)合于Sycp1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1276bp、-708bp和-94bp E-box結(jié)構(gòu)域,能夠結(jié)合于Sycp3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-64bp和-43bp E-box結(jié)構(gòu)域。結(jié)論:1、Sohlh1基因缺失小鼠精母細(xì)胞發(fā)育阻滯在減數(shù)分裂期。2、減數(shù)分裂相關(guān)基因Sycp1和Sycp3是Sohlh1基因敲除小鼠精母細(xì)胞發(fā)育阻滯的重要候選基因。3、Sohlh1基因缺失小鼠精母細(xì)胞聯(lián)會(huì)復(fù)合體異常,染色體無(wú)法形成聯(lián)會(huì)。4、Sohlh1基因缺失小鼠聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白SYCP1和SYCP3表達(dá)顯著下調(diào),SOHLH1蛋白與SYCP3蛋白在出生后14.5天小鼠睪丸組織中共表達(dá)。4、雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí),轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對(duì)聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白基因Sycp1和Sycp3表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄激活作用。5、在小鼠睪丸中,轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1能夠結(jié)合于Sycp1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1276bp、-708bp和-94bp E-box結(jié)構(gòu)域,對(duì)Sycp1具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;能夠結(jié)合于Sycp3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-64bp和-43bp E-box結(jié)構(gòu)域,通過(guò)-64bp E-box結(jié)構(gòu)域?qū)ycp3具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;Q23
【圖文】：

圖 2.1 技術(shù)路線(xiàn)圖2.3 實(shí)驗(yàn)方法2.3.1 Sohlh1 KO 與 WT 小鼠基因型鑒定取 7.5d 雄鼠鼠尾，約 0.5cm 長(zhǎng)，置于 1.5mL 離心管中，加入 500μL 鼠尾消化液（NaCl 2.93g,SDS 2.5g,1M Tris-HCl pH8.0 5mL,0.5M EDTApH8.0 10mL 定容至 500mL）和 5μL 蛋白酶 K，55°C 水浴鍋中消化過(guò)夜，加入 500μL 苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），上下顛倒 15 次混勻，12000g 離心 10min。小心取出離心管吸取 380μL 上清液至新 1.5mL 離心管中，加入等體積異丙醇后上下顛倒 15 次至出現(xiàn)白色絮狀物沉淀，12000g 離心 10min。棄上清后加入 500μL75%酒精，輕彈管底將使白色沉淀懸浮，12000g離心10min。棄上清，室溫晾干后加入40μLddH2O溶解 DNA 過(guò)夜，4°C 保存。分別用基因鑒定引物以提取鼠尾 DNA 為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段拍照。

3 結(jié)果 KO 與 WT 小鼠基因型鑒定hlh1-KO 引物獲得的 PCR 產(chǎn)物為基因敲除打靶載體中DNA 片段；使用 Sohlh1-WT 引物獲得的 PCR 產(chǎn)物為DNA 片段�？筛鶕�(jù)兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定小鼠基因型除小鼠的基因組部分外顯子被打靶載體序列所取物 PCR 擴(kuò)增后電泳產(chǎn)物僅可見(jiàn) Sohlh1-KO 引物 PCR一個(gè)等位基因含有 Sohlh1 全部外顯子，另一等位基 PCR 后產(chǎn)物既有 Sohlh1-WT 引物擴(kuò)增產(chǎn)物又有 Soh型小鼠基因組中無(wú)打靶載體序列插入，無(wú)外顯子被敲物擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖 3.2 不同階段小鼠外觀(guān)及睪丸外觀(guān)觀(guān)察A、B 分別為 PD7.5 WT 和 KO 雄鼠外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；C、D 分別為 PD10.5 WT 和KO 雄鼠外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；I、J 分別為 PD14.5 WT 和 KO 雄鼠外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；K、L 分別為 PD23.5 WT 和 KO 雄鼠外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；Q、R 分別為 PD49.5 WT 和 KO 雄鼠外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；E、F 分別為 PD7.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；G、H分別為 PD10.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；M、N 分別為 PD14.5 WT 和 KO雄鼠睪丸外觀(guān)，未見(jiàn)明顯差異；O、P 分別為 PD23.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀(guān)，KO 睪丸明顯小于 WT；S、T 分別為 PD49.5 WT 和 KO 雄鼠睪丸外觀(guān)，KO 睪丸明顯小于 WT。3.3 不同階段小鼠睪丸組織切片 HE 觀(guān)察成年小鼠睪丸曲細(xì)精管中存在各期生精細(xì)胞，其形態(tài)如圖 3.3 所示。HE 染色 A 型精原細(xì)胞核體積較小，染色較淺，核膜內(nèi)側(cè)可見(jiàn)深染染色質(zhì)（圖 3.3A）；中間型和 B 型精原細(xì)胞與 A 型精原細(xì)胞相似，但核膜內(nèi)側(cè)深染染色質(zhì)數(shù)目增多

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4 葉楠;g墻

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