【摘要】：[目的]檢測腎小管上皮細胞HK2在感染狀態(tài)下細胞中抗菌肽LL-37的表達情況,探討LL-37與腎臟感染的關(guān)系,同時初步建立LL-37基因敲除的HK2細胞系。[方法]在體外將不同濃度的LPS(0、0.1、1、10ug/ml)作用于腎小管上皮細胞HK2,其中Oug/mlLPS組作為對照組,0.1、1、1Oug/mlLPS組設為實驗組。LPS刺激12h后,分別采用RT-PCR和western blot檢測HK2細胞中LL-37mRNA和蛋白的表達水平,并通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中LL-37蛋白的相應濃度。同時,采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對HK2細胞的LL-37基因進行敲除,后期通過流式細胞儀、嘌呤霉素及單克隆挑取等方法篩選穩(wěn)定株,最后利用western blot對基因敲除的穩(wěn)定株進行初步鑒定。[結(jié)果]RT-PCR相對定量結(jié)果顯示除了 0.1ug/ml組外,實驗組中LL-37mRNA的表達水平均明顯高于對照組;western blot檢測發(fā)現(xiàn)實驗組HK2細胞中LL-37蛋白的表達均高于對照組;ELISA結(jié)果表明1、10ug/ml的LPS可刺激HK2細胞分泌LL-37蛋白;以上三種檢測結(jié)果均提示LPS對LL-37的表達呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。同時,LL37-KO和LL37-HDR兩質(zhì)粒對HK2細胞的轉(zhuǎn)染效率較高,且與正常HK2細胞相比,對基因敲除細胞株行WB檢測未見LL-37蛋白的表達。[結(jié)論]未感染狀態(tài)下的腎小管上皮細胞HK2中抗菌肽LL-37的表達很少,而適宜濃度的LPS則可促進HK2細胞LL-37mRNA及蛋白的表達,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,提示LL-37可能在腎小管上皮細胞發(fā)生感染時發(fā)揮一定的作用,參與腎臟感染的免疫應答。同時,WB結(jié)果表明本實驗中HK2細胞LL-37基因敲除的效果較理想。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692
【圖文】：

１．邋ＲＴ－ＰＣＲ法檢測不同濃度ＬＰＳ刺激ＨＫ２細胞后ＬＬ－３７ｍＲＮＡ的表達情況逡逑１．１邐ＲＮＡ電泳結(jié)果采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取各組細胞的總ＲＮＡ后，進行電泳檢測逡逑（１．５％瓊脂糖，ｌｘＴＡＥ電泳緩沖液），由圖１可見２８ＳｒＲＮＡ的亮度是１８ＳｒＲＮＡ逡逑的２倍左右，表明所提取的ＲＮＡ無降解，質(zhì)量高。逡逑｜５ＳＳ｜；ｉｏｏｏ逡逑—８００邐ｍｉ逡逑－．＾邋（＞00邋Ｉ逡逑圖１各組細胞總ＲＮＡ電泳檢測圖譜（注：左邊的Ｍａｒｋｅｒ為ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，逡逑其只為檢測基因組污染，并不代表ＲＮＡ實際條帶的大小）逡逑１．２邋ＰＣＲ溶解曲線將逆轉(zhuǎn)錄合成的ｃＤＮＡ行ＰＣＲ反應，發(fā)現(xiàn)各組目的基因逡逑ＬＬ－３７和內(nèi)參基因ＧＡＰＤＨ的溶解曲線均為單一波峰，沒有其余雜峰出現(xiàn)，表明逡逑所得到的產(chǎn)物特異性高，無引物二聚體和非特異性條帶的形成。（圖２、圖３）逡逑２０逡逑

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【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 田鵬鵬;朱麗莎;馬青;艾彪;田甜;;尿路感染中腸球菌的分布及耐藥性分析[J];中華醫(yī)院感染學雜志;2017年04期

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1 潘廣瑞;抗菌肽LL-37對膀胱腫瘤細胞抑制作用的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

本文編號：2742942