發(fā)布時(shí)間：2020-07-05 17:49

【摘要】：[目的]檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞HK2在感染狀態(tài)下細(xì)胞中抗菌肽LL-37的表達(dá)情況,探討LL-37與腎臟感染的關(guān)系,同時(shí)初步建立LL-37基因敲除的HK2細(xì)胞系。[方法]在體外將不同濃度的LPS(0、0.1、1、10ug/ml)作用于腎小管上皮細(xì)胞HK2,其中Oug/mlLPS組作為對(duì)照組,0.1、1、1Oug/mlLPS組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。LPS刺激12h后,分別采用RT-PCR和western blot檢測(cè)HK2細(xì)胞中LL-37mRNA和蛋白的表達(dá)水平,并通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LL-37蛋白的相應(yīng)濃度。同時(shí),采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)HK2細(xì)胞的LL-37基因進(jìn)行敲除,后期通過(guò)流式細(xì)胞儀、嘌呤霉素及單克隆挑取等方法篩選穩(wěn)定株,最后利用western blot對(duì)基因敲除的穩(wěn)定株進(jìn)行初步鑒定。[結(jié)果]RT-PCR相對(duì)定量結(jié)果顯示除了 0.1ug/ml組外,實(shí)驗(yàn)組中LL-37mRNA的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組;western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組HK2細(xì)胞中LL-37蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組;ELISA結(jié)果表明1、10ug/ml的LPS可刺激HK2細(xì)胞分泌LL-37蛋白;以上三種檢測(cè)結(jié)果均提示LPS對(duì)LL-37的表達(dá)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。同時(shí),LL37-KO和LL37-HDR兩質(zhì)粒對(duì)HK2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高,且與正常HK2細(xì)胞相比,對(duì)基因敲除細(xì)胞株行WB檢測(cè)未見(jiàn)LL-37蛋白的表達(dá)。[結(jié)論]未感染狀態(tài)下的腎小管上皮細(xì)胞HK2中抗菌肽LL-37的表達(dá)很少,而適宜濃度的LPS則可促進(jìn)HK2細(xì)胞LL-37mRNA及蛋白的表達(dá),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,提示LL-37可能在腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生感染時(shí)發(fā)揮一定的作用,參與腎臟感染的免疫應(yīng)答。同時(shí),WB結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)中HK2細(xì)胞LL-37基因敲除的效果較理想。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692
【圖文】：

１．邋ＲＴ－ＰＣＲ法檢測(cè)不同濃度ＬＰＳ刺激ＨＫ２細(xì)胞后ＬＬ－３７ｍＲＮＡ的表達(dá)情況逡逑１．１邐ＲＮＡ電泳結(jié)果采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取各組細(xì)胞的總ＲＮＡ后，進(jìn)行電泳檢測(cè)逡逑（１．５％瓊脂糖，ｌｘＴＡＥ電泳緩沖液），由圖１可見(jiàn)２８ＳｒＲＮＡ的亮度是１８ＳｒＲＮＡ逡逑的２倍左右，表明所提取的ＲＮＡ無(wú)降解，質(zhì)量高。逡逑｜５ＳＳ｜；ｉｏｏｏ逡逑—８００邐ｍｉ逡逑－．＾邋（＞00邋Ｉ逡逑圖１各組細(xì)胞總ＲＮＡ電泳檢測(cè)圖譜（注：左邊的Ｍａｒｋｅｒ?yàn)椋模危铃澹停幔颍耄澹�，逡逑其只為檢測(cè)基因組污染，并不代表ＲＮＡ實(shí)際條帶的大�。╁义希保插澹校茫胰芙馇�將逆轉(zhuǎn)錄合成的ｃＤＮＡ行ＰＣＲ反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)各組目的基因逡逑ＬＬ－３７和內(nèi)參基因ＧＡＰＤＨ的溶解曲線均為單一波峰，沒(méi)有其余雜峰出現(xiàn)，表明逡逑所得到的產(chǎn)物特異性高，無(wú)引物二聚體和非特異性條帶的形成。（圖２、圖３）逡逑２０逡逑

１．２邋ＰＣＲ溶解曲線將逆轉(zhuǎn)錄合成的ｃＤＮＡ行ＰＣＲ反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)各組目的基因逡逑ＬＬ－３７和內(nèi)參基因ＧＡＰＤＨ的溶解曲線均為單一波峰，沒(méi)有其余雜峰出現(xiàn)，表明逡逑所得到的產(chǎn)物特異性高，無(wú)引物二聚體和非特異性條帶的形成。（圖２、圖３）逡逑２０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 田鵬鵬;朱麗莎;馬青;艾彪;田甜;;尿路感染中腸球菌的分布及耐藥性分析[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2017年04期

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1 潘廣瑞;抗菌肽LL-37對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2742942