【摘要】：在不利環(huán)境下,植物體能夠迅速感知并發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),包括體內(nèi)生理代謝改變、激素等物質(zhì)含量發(fā)生變化、抗逆相關(guān)基因表達量改變等等。糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負責糖基化修飾的一類酶。植物分子被糖基化后能夠改變分子的水溶性以及生物活性,進而對植物的生理活動產(chǎn)生影響。根據(jù)公開發(fā)表的基因芯片數(shù)據(jù)得知,擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1的表達能夠?qū)Ψ巧锩{迫做出響應(yīng)。暗示該基因可能參與植物對非生物脅迫的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。為了明確糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1在植物應(yīng)對逆境脅迫中的作用,開展了本課題研究。首先對野生型擬南芥進行了 NaCl和Mannitol的脅迫處理,并用qPCR技術(shù)檢測了UGT86A1在脅迫處理后的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),UGT86A1受非生物脅迫誘導(dǎo)表達上調(diào)。然后,構(gòu)建了UGT86A1的CRISPR/Cas9敲除載體、過表達載體、GUS報告載體以及原核表達載體,并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功獲得了UGT86A1的敲除株系、過表達株系、GUS轉(zhuǎn)基因株系以及原核表達菌株。UGt86A1啟動子:GUS轉(zhuǎn)基因株系在經(jīng)過NaCl和Mannitol處理以后,GUS染色較對照明顯加深,進一步證明了UGT86A1受非生物脅迫誘導(dǎo)表達。通過對UGT86A1敲除株系和過表達株系一系列的逆境適應(yīng)性分析,發(fā)現(xiàn)在NaCl和Mannitol的逆境處理下,與野生型相比,UGT86A1敲除株系無論是在種子萌發(fā)、子葉轉(zhuǎn)綠還是在主根伸長等方面都表現(xiàn)出對逆境敏感的表型。與此相反,UGT86A1的過表達株系都表現(xiàn)出對逆境耐性增強的表型。在土壤培養(yǎng)條件下,同樣進行了耐鹽和耐旱實驗。實驗結(jié)果表明,UGT86A1敲除株系在鹽和干旱處理條件下都比野生型的存活率低,而過表達株系都比野生型的存活率高。這些結(jié)果說明了UGT86A1無論是在植物萌發(fā)期還是在苗期都參與了植物對逆境的適應(yīng)性調(diào)節(jié),能夠增強植物的耐逆性。為了探索UGT86A1在植物應(yīng)對逆境脅迫中的作用機制,測定了UGT86A1敲除體和過表達體在逆境條件下的生理學變化。首先統(tǒng)計了UGT86A 敲除系和過表達系的離體葉片失水率,并觀察了葉片在干旱條件下的氣孔開度。發(fā)現(xiàn)UGT86A1敲除株系的離體葉片失水率高,而UGT86AI過表達株系離體葉片失水率相對較低。與之相一致,發(fā)現(xiàn)在干旱條件下,敲除株系氣孔開度較大,而過表達株系氣孔開度較小。這表明UGT86A1的生理學功能可能與氣孔運動有某種聯(lián)系,它的功能喪失導(dǎo)致在干旱條件下葉片失水較快。進一步測定了 UGT86A1敲除體和過表達體在逆境環(huán)境下與耐逆相關(guān)的其他一些生理學變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在UGT86A1敲除體中,可溶性糖的含量比野生型低,而丙二醛的含量比野生型高。而在UGT86A1過表達體中,可溶性糖的含量比野生型高,丙二醛的含量比野生型低。通過鹽處理和干旱條件下的總抗氧化能力測定以及葉片細胞學染色技術(shù),發(fā)現(xiàn)UGT86A1敲除體的清除活性氧的能力低于野生型,過表達體清除活性氧的能力高于野生型。這些實驗數(shù)據(jù)說明UGT86A1的作用可能還涉及到滲透保護、膜的穩(wěn)定性以及活性氧清除等方面。最后檢測了UGT86A 敲除體和UGT86A1過表達體在逆境條件下抗逆相關(guān)基因表達量的變化,包括DREB2A、RD29B、AIL1、RD22、COC47和CAT1等。發(fā)現(xiàn)這些抗逆相關(guān)基因在UGT86A1敲除體中的表達普遍下調(diào),而在過表達體中表達上調(diào)。我們推測,UGT86A1之所以能夠引起以上多種生理學指標的變化,可能與這些耐逆相關(guān)基因的表達變化有關(guān)系。本研究曾試圖從糖基轉(zhuǎn)移酶的底物入手進一步挖掘UGT86A1發(fā)揮作用的分子機制,但由于酶蛋白表達和純化的困難,目前在底物鑒定方面還沒有獲得進展。總之,通過對UGT86A1突變體和過表達體的一系列研究,明確了糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1在增強植物對非生物脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。同時,初步發(fā)現(xiàn)UUGT86A1基因在逆境環(huán)境下可能通過影響抗逆相關(guān)基因的表達,進而對植物抗逆的的生理學過程產(chǎn)生影響。糖基轉(zhuǎn)移酶UGT86A1的底物鑒定以及UGT86AI發(fā)揮作用的深層分子機理,還需要進一步研究。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

１．２．２調(diào)節(jié)植物激素平衡逡逑植物激素是一種天然條件下所產(chǎn)生的有機物質(zhì)，其濃度的高低會影響植物的逡逑生理過程，包括影響植物的生長、分化和發(fā)育，也包括影響氣孔運動等其他生理逡逑過程（Ａｃｈａｒｄ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６；邋Ｄａｖｉｅｓ，邋２０１０）。逡逑Ｈｏｕ等（２００４）通過體外生化實驗鑒定了擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ＵＧＴ７６Ｃ１能夠逡逑糖基化細胞分裂素，并且在對ｔ／Ｇ７７（５Ｃ７突變體外源添加細胞分裂素后，突變體逡逑植株表現(xiàn)為主根更長，葉綠素增多和花青素積累增加。這說明Ｃ／Ｇ７７６Ｃ／能夠調(diào)逡逑節(jié)植物體內(nèi)細胞分裂素含量的平衡并可能間接維持了其他小分子物質(zhì)含量的平逡逑衡。擬南芥ＵＧＴ７６Ｃ１氧化的是細胞分裂素的Ｎ位，擬南芥ＵＧＴ７３Ｃ１、ＵＧＴ７３Ｃ５、逡逑ＵＧＴ８５Ａ１還能夠糖基化細胞分裂素的ＯＨ位（Ｈｏｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。Ｌｉｕ等（２０１５）逡逑分析鑒定了擬南芥ＵＧＴ７１Ｃ５通過對脫落酸（ＡＢＡ）的糖基化修飾調(diào)節(jié)了植物體逡逑１２逡逑

山東大學碩士學位論文逡逑ａｌ．，邋２０１４）。微陣列和ＲＮＡ凝膠檢測分析表明，ＤＲＥＢ２Ａ調(diào)節(jié)了許多與滲透脅迫逡逑相關(guān)基因的表達。細胞核中位于ＤＲＥＢ２Ａ的１３６和１６５位點間的殘基對蛋白質(zhì)逡逑的穩(wěn)定性起著重要作用，這也對蛋白質(zhì)的激活產(chǎn)生影響（Ｓａｋｕｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６ａ；逡逑Ｓａｋｕｍａｅｔａｌ．，２００６ｂ）。這表明了在非生物脅迫條件下，植物體抗逆性能的改變，逡逑其體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子ＤＲＥＢ２Ａ的表達也應(yīng)當發(fā)生相應(yīng)變化（Ｓａｋｕｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６；逡逑Ｋｉｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１；邋Ｋｉｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。逡逑

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