【摘要】：在不利環(huán)境下,植物體能夠迅速感知并發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),包括體內(nèi)生理代謝改變、激素等物質(zhì)含量發(fā)生變化、抗逆相關(guān)基因表達(dá)量改變等等。糖基轉(zhuǎn)移酶是專(zhuān)門(mén)負(fù)責(zé)糖基化修飾的一類(lèi)酶。植物分子被糖基化后能夠改變分子的水溶性以及生物活性,進(jìn)而對(duì)植物的生理活動(dòng)產(chǎn)生影響。根據(jù)公開(kāi)發(fā)表的基因芯片數(shù)據(jù)得知,擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1的表達(dá)能夠?qū)Ψ巧锩{迫做出響應(yīng)。暗示該基因可能參與植物對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。為了明確糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中的作用,開(kāi)展了本課題研究。首先對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行了 NaCl和Mannitol的脅迫處理,并用qPCR技術(shù)檢測(cè)了UGT86A1在脅迫處理后的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),UGT86A1受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。然后,構(gòu)建了UGT86A1的CRISPR/Cas9敲除載體、過(guò)表達(dá)載體、GUS報(bào)告載體以及原核表達(dá)載體,并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功獲得了UGT86A1的敲除株系、過(guò)表達(dá)株系、GUS轉(zhuǎn)基因株系以及原核表達(dá)菌株。UGt86A1啟動(dòng)子:GUS轉(zhuǎn)基因株系在經(jīng)過(guò)NaCl和Mannitol處理以后,GUS染色較對(duì)照明顯加深,進(jìn)一步證明了UGT86A1受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)對(duì)UGT86A1敲除株系和過(guò)表達(dá)株系一系列的逆境適應(yīng)性分析,發(fā)現(xiàn)在NaCl和Mannitol的逆境處理下,與野生型相比,UGT86A1敲除株系無(wú)論是在種子萌發(fā)、子葉轉(zhuǎn)綠還是在主根伸長(zhǎng)等方面都表現(xiàn)出對(duì)逆境敏感的表型。與此相反,UGT86A1的過(guò)表達(dá)株系都表現(xiàn)出對(duì)逆境耐性增強(qiáng)的表型。在土壤培養(yǎng)條件下,同樣進(jìn)行了耐鹽和耐旱實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,UGT86A1敲除株系在鹽和干旱處理?xiàng)l件下都比野生型的存活率低,而過(guò)表達(dá)株系都比野生型的存活率高。這些結(jié)果說(shuō)明了UGT86A1無(wú)論是在植物萌發(fā)期還是在苗期都參與了植物對(duì)逆境的適應(yīng)性調(diào)節(jié),能夠增強(qiáng)植物的耐逆性。為了探索UGT86A1在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中的作用機(jī)制,測(cè)定了UGT86A1敲除體和過(guò)表達(dá)體在逆境條件下的生理學(xué)變化。首先統(tǒng)計(jì)了UGT86A 敲除系和過(guò)表達(dá)系的離體葉片失水率,并觀察了葉片在干旱條件下的氣孔開(kāi)度。發(fā)現(xiàn)UGT86A1敲除株系的離體葉片失水率高,而UGT86AI過(guò)表達(dá)株系離體葉片失水率相對(duì)較低。與之相一致,發(fā)現(xiàn)在干旱條件下,敲除株系氣孔開(kāi)度較大,而過(guò)表達(dá)株系氣孔開(kāi)度較小。這表明UGT86A1的生理學(xué)功能可能與氣孔運(yùn)動(dòng)有某種聯(lián)系,它的功能喪失導(dǎo)致在干旱條件下葉片失水較快。進(jìn)一步測(cè)定了 UGT86A1敲除體和過(guò)表達(dá)體在逆境環(huán)境下與耐逆相關(guān)的其他一些生理學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在UGT86A1敲除體中,可溶性糖的含量比野生型低,而丙二醛的含量比野生型高。而在UGT86A1過(guò)表達(dá)體中,可溶性糖的含量比野生型高,丙二醛的含量比野生型低。通過(guò)鹽處理和干旱條件下的總抗氧化能力測(cè)定以及葉片細(xì)胞學(xué)染色技術(shù),發(fā)現(xiàn)UGT86A1敲除體的清除活性氧的能力低于野生型,過(guò)表達(dá)體清除活性氧的能力高于野生型。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明UGT86A1的作用可能還涉及到滲透保護(hù)、膜的穩(wěn)定性以及活性氧清除等方面。最后檢測(cè)了UGT86A 敲除體和UGT86A1過(guò)表達(dá)體在逆境條件下抗逆相關(guān)基因表達(dá)量的變化,包括DREB2A、RD29B、AIL1、RD22、COC47和CAT1等。發(fā)現(xiàn)這些抗逆相關(guān)基因在UGT86A1敲除體中的表達(dá)普遍下調(diào),而在過(guò)表達(dá)體中表達(dá)上調(diào)。我們推測(cè),UGT86A1之所以能夠引起以上多種生理學(xué)指標(biāo)的變化,可能與這些耐逆相關(guān)基因的表達(dá)變化有關(guān)系。本研究曾試圖從糖基轉(zhuǎn)移酶的底物入手進(jìn)一步挖掘UGT86A1發(fā)揮作用的分子機(jī)制,但由于酶蛋白表達(dá)和純化的困難,目前在底物鑒定方面還沒(méi)有獲得進(jìn)展�？傊�,通過(guò)對(duì)UGT86A1突變體和過(guò)表達(dá)體的一系列研究,明確了糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1在增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí),初步發(fā)現(xiàn)UUGT86A1基因在逆境環(huán)境下可能通過(guò)影響抗逆相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而對(duì)植物抗逆的的生理學(xué)過(guò)程產(chǎn)生影響。糖基轉(zhuǎn)移酶UGT86A1的底物鑒定以及UGT86AI發(fā)揮作用的深層分子機(jī)理,還需要進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【圖文】：

１．２．２調(diào)節(jié)植物激素平衡逡逑植物激素是一種天然條件下所產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)，其濃度的高低會(huì)影響植物的逡逑生理過(guò)程，包括影響植物的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育，也包括影響氣孔運(yùn)動(dòng)等其他生理逡逑過(guò)程（Ａｃｈａｒｄ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６；邋Ｄａｖｉｅｓ，邋２０１０）。逡逑Ｈｏｕ等（２００４）通過(guò)體外生化實(shí)驗(yàn)鑒定了擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ＵＧＴ７６Ｃ１能夠逡逑糖基化細(xì)胞分裂素，并且在對(duì)ｔ／Ｇ７７（５Ｃ７突變體外源添加細(xì)胞分裂素后，突變體逡逑植株表現(xiàn)為主根更長(zhǎng)，葉綠素增多和花青素積累增加。這說(shuō)明Ｃ／Ｇ７７６Ｃ／能夠調(diào)逡逑節(jié)植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素含量的平衡并可能間接維持了其他小分子物質(zhì)含量的平逡逑衡。擬南芥ＵＧＴ７６Ｃ１氧化的是細(xì)胞分裂素的Ｎ位，擬南芥ＵＧＴ７３Ｃ１、ＵＧＴ７３Ｃ５、逡逑ＵＧＴ８５Ａ１還能夠糖基化細(xì)胞分裂素的ＯＨ位（Ｈｏｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。Ｌｉｕ等（２０１５）逡逑分析鑒定了擬南芥ＵＧＴ７１Ｃ５通過(guò)對(duì)脫落酸（ＡＢＡ）的糖基化修飾調(diào)節(jié)了植物體逡逑１２逡逑

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逑ａｌ．，邋２０１４）。微陣列和ＲＮＡ凝膠檢測(cè)分析表明，ＤＲＥＢ２Ａ調(diào)節(jié)了許多與滲透脅迫逡逑相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞核中位于ＤＲＥＢ２Ａ的１３６和１６５位點(diǎn)間的殘基對(duì)蛋白質(zhì)逡逑的穩(wěn)定性起著重要作用，這也對(duì)蛋白質(zhì)的激活產(chǎn)生影響（Ｓａｋｕｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６ａ；逡逑Ｓａｋｕｍａｅｔａｌ．，２００６ｂ）。這表明了在非生物脅迫條件下，植物體抗逆性能的改變，逡逑其體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子ＤＲＥＢ２Ａ的表達(dá)也應(yīng)當(dāng)發(fā)生相應(yīng)變化（Ｓａｋｕｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６；逡逑Ｋｉｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１；邋Ｋｉｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。逡逑

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本文編號(hào)：2742832